烟草对氧化胁迫的耐受性分析

1、PNAS August 6, 2002 vol. 99 no. 16 10871文献摘要引言材料与方法结果讨论目录 由植物适应氧化应激(胁迫)的分子机制了解甚少。为了鉴定该适应的过程，我们对烟草叶片适应氧化应激进行了基因表达的综合分析。结合mRNA差异显示和cDNA阵列分析，我们估计至少有95个基因在烟叶适应氧化应激过程中它们的表达会改变，其中83 被诱发，17被抑制。 53个序列标签序列分析表明，除了抗氧化基因，与生物和非生物胁迫的防御、细胞保护和解毒、能量和碳水化合物的代谢、新蛋白的合成和信号转导等相关的基因表达也被改变。大部分基因的表达增强，但是除了与光合作用和光调节过程相关的基因被抑制

2、了。摘要 在植物适应氧化胁迫过程中，观察到共调节基因的两个不同的群体（“早期” 和“晚期响应”基因调节子），这表明至少有两个不同的基因诱导途径的存在。这两个基因调节子对氧化应激也表现出的两种不同的表达模式。在适应胁迫的叶片部位“后期响应”基因表达增强，而“早期反应”基因的表达则不是。总之，我们的数据表明，对氧化应激的适应是与广泛的基因表达的调节相关联的一个非常复杂的过程。此外，我们的数据表明，除了防卫基因诱导，植物过敏加强了基因表达可能是适应氧化应激的一个重要因素。 植物处于非致死的生物或非生物胁迫时，通常会呈现对一般的，剂量相同的致死因子的耐受性，而这种现象被称为驯化（适应）或获得抗病性。这

3、种诱导产生的胁迫抗性并不限于同一类型的胁迫，也有关于不同的应激之间的交叉耐受性的相关报道。由于许多胁迫条件导致细胞氧化还原失衡，有研究表明植物对氧化应激的防御有助于诱导对非生物和生物胁迫的耐受性，而且是交叉耐受性介导的关键成分。有个现象也说明这个概念，即适应热或冷的植物会呈现对病原体的抗性并对氧化应激产生更高的耐受性。引言 抗氧化防御反应主要是增强抗氧化酶活性和增加抗氧化代谢物的水平，如抗坏血酸，谷胱甘肽，-生育酚和类胡萝卜素。最近更多研究发现，诱导小热激蛋白，细胞保护基因谷胱甘肽转移酶（GST）和发病机理相关基因PR2都与对氧化胁迫的耐性相关。 对各种氧化剂的适应反应已在细菌和酵母中被广泛研

4、究。在细菌中，通过亚致死剂量的氧化应激产生了至少80种蛋白，并触发对致死的氧化胁迫的耐受性，而酵母中至少有900个基因的表达受到影响。为了解更多氧化应激使植物获得抗性的分子机制，我们用mRNA差异显示分析烟草叶片对氧化应激的基因表达的变化。本研究显示了该过程的高度复杂性，并揭示了其基因和机制，为氧化胁迫耐性的研究做出贡献。1 1、植物植物材料、培养条件和甲基紫材料、培养条件和甲基紫精精 ( (MVMV) ) Methyl Methyl ViologenViologen处理处理 在100mol m-2s-1的光子通量下，16小时的光照和8小时的黑暗，70%的相对湿度，恒温24C的条件下生长5周，

5、不同的植物中切出3个直径1cm的圆孔，近轴端施用12ml的甲基紫精溶液，对照组使用超纯水。使用电导仪测定叶盘离子渗漏溶液的导电性。2 2、 RNA RNA提取和提取和RNARNA凝胶印记凝胶印记分析分析3、差异显示差异显示4、 DNA序列分析序列分析材料和方法1、烟草烟草对甲基紫精的对甲基紫精的敏感性敏感性为了鉴定植物中基因对适应氧化胁迫的差异表达，使用MV。虽然低浓度的AOS诱导防御反应，但高浓度的AOS导致细胞死亡。为了避免细胞恶化基因的表达，我们首先确定亚致死MV的浓度。为此，烟草叶盘上用不同浓度的MV，并监测溶质的电导率。结果相比用水处理过的叶盘，0.2 M和较低浓度的MV只造成较小的

6、离子渗漏，即使经过42小时的培养也并没有观察到明显的损伤，（图1）。在随后的实验中，上述浓度的MV用于诱导对氧化应激的耐受性。大于0.2M的浓度导致了大量的离子渗漏和细胞死亡（图1），并用于评估植物对氧化胁迫的耐受性。2 2、亚致死剂量的亚致死剂量的MVMV处理使得烟草叶片对致死剂量的处理使得烟草叶片对致死剂量的MVMV诱导的氧化胁迫产生适应性诱导的氧化胁迫产生适应性。 使用0.2M MV或更低浓度（预处理）各种时期的烟草叶盘随后转移到含有致命剂量的MV溶液中做耐受性评估（处理）。当叶盘用0.1M MV进行预处理17小时（含8小时黑暗期）并在一个11小时的处理后进行抗逆性评估，烟叶对MV的抗性

7、非常显著（与水处理的对照组，实验组溶质电导率减少了40 ）（图2A ）。为了测试这种对MV的耐性究竟不仅仅只是一种生理反应，还涉及核基因表达的改变，通过Northern杂交检测mRNA水平的抗氧化基因GPX和SodCc被检测。0.1M MV预处理的叶片中这两种抗氧化基因都被诱导，并且在整个氧化应激的适应期样品中它们的的表达增强了（图2B）。这一观察结果表明，烟叶对 MV强加的氧化胁迫不仅是一种生理反应，还涉及核基因表达的改变，说明GPX和SodCc起到增强耐受性的作用。3 3、对耐药性的烟叶做全基因组表达分析。对耐药性的烟叶做全基因组表达分析。 为了阐明氧化胁迫耐受性增强的的分子过程，进行了全

8、基因组表达分析。通过mRNA差异显示技术对无论是水或0.1MMV预处理17小时的烟草叶盘进行了对比。用80个引物组合，耐受性和无耐受性的样品中始终差异表达的大于150 bp的243个带（表1）被鉴定出来。对146个带的序列分析表明，50 的频带是含有两个或更多不同的cDNA片段的混合体。因此，源于这146个带的单一序列被重新扩增，摆着尼龙膜上，并与来自耐受性和无耐受性的烟草叶盘中的cDNA探针杂交。 对13个诱导表达的基因进行了测试，并通过RNA凝胶印迹分析来重新确认，验证cDNA微阵列分析的结果。4 4、氧化应激处理过程中诱导基因的差氧化应激处理过程中诱导基因的差异表达异表达 对0.1MMV

9、预处理（驯化）和随后的1MMV处理过程中的11个选择的基因的表达进行了分析（氧化应激，图3）。在预处理的第一个4小时，除了多功能蛋白（MFP）和脂氧合酶2（LOX2）的基因密码被诱导外，水和MV预处理的样品中并没有明显的诱导基因表达，可能是叶盘正在适应的结果。经过12小时后，暴露在0.1MMV中的样本所有的基因被诱导。然而，在这个时间点，感应还是相当低，可能反映了前8小时的黑暗期（无光合活性）需要由MV积累最大量的超氧化物。最后5小时在光照下的预处理过程增强了mRNA的诱导。 在随后的1M MV处理，无耐性的样品中的所有基因被诱导并且产生耐性的样品中（ forLox2除外）的基因被进一步诱导。

10、一组基因（EAS ， TPK， LOX2 ，和MFP ）被1M MV迅速诱导（3和6小时之间达到峰值），并且这两个未处理和预处理过的样品在相同的水平（图3）。在基因的第二组（ PRB- 1b中， CBP20 ，VS MDR ， DNAJ ，和WRKY11 ），感应是相当缓慢的，无耐受性的样品在6和9小时之间达到最大表达水平，适应的样品中是3和6小时。基因的第二组中适应的样品表达明显要高，1M MV处理后至少6小时，也不像非适应样本中的那么高。测试的所有基因的转录水平在处理结束后下降。在抗氧化基因GPX和SodCc中观察到类似的表达模式（图2 ）。5、通过聚类分析确定基因共表达的两个主要调控子通

11、过聚类分析确定基因共表达的两个主要调控子。 通过MV氧化应激处理过程中挑选出来的基因的差异表达表明，可能是由不同途径来激活基因。为了探讨这种可能性，在0.1M MV预处理过程中进行更详细的基因表达分析。 基于基因表达谱，两个共调节基因（调控子）的大型集群被鉴定出来（图4）。一个集群（图4A）含有的基因它们的表达在预处理15小时结束前达到高峰，然后下降（早期反应基因）。第二个簇（集群）（图4B）的基因的表达仍然很高，持续到预处理结束时（晚期反应基因）。有趣的是，在氧化应激处理过程中耐受性叶盘表达增大的基因（ PRB- 1b中， CBP20 ，VS MDR ， DNAJ ， WRKY11 ，谷胱甘

12、肽过氧化物，和ATPCL ）都属于晚期反应基因簇，而其他（EAS ， TPK ， LOX2和MFP）是早期反应基因簇的一部分。基因的聚类表明，它们由相同的信号通路调节类似的细胞过程中的功能。因此，耐受性烟草叶盘中被诱导的基因的表达可能通过一个MV-依赖的方式来调节包括至少两种不同的的信号转导通路，并且两组共调节基因可能在氧化应激的适应中扮演特异的角色。 为了表述植物中与氧化胁迫耐性相关的分子反应特征，我们对适应氧化应激的烟草叶盘进行全基因组基因表达分析。当我们用mRNA差异显示时，我们发现耐受性叶盘中至少有95个基因表达增强了大约2倍。通过已测序的146条带对总共4712条带进行评分来显示53

13、70不同的mRNA。因此，基于这个亚群的基因的分析，预测在已适应叶盘中有1.8 的烟草基因改变了它们的表达。这些数据与Desikanet等人的结果相似，他们发现的拟南芥暴露于过氧化氢后有2.1的基因的表达改变了1.5倍。讨论 在烟草中发现了与已知或预测的序列相似的27cDNA片段，占所有测序cDNA的50 。高百分比的cDNA但在序列数据库中并无同源性可能是由于分离的cDNAs主要包含3 非翻译区，而该序列的差异非常高造成的。在这些分离的基因片段中，我们鉴定的基因和先前与耐受性相关的氧化应激（表2）基因并无联系。其中几个已经注释出或可以预测到有细胞保护或解毒功能，例如，多药耐药基因MDR编码A

14、BC转运蛋白可以排出在哺乳动物细胞中的两亲性的药物和有毒的代谢产物， DNAJ编码一种分子伴侣， EH - 1编码环氧化物水解酶，作用是转化反应活性高的环氧化物水解为无害的二醇。植物解毒反应，集中在被氧化的细胞分子，但也会还集中到MV本身所在位置，因此，植物细胞中低水平的MV也可增强植物对MV解毒反应。 基因编码的苯丙烷途径（ ISI10a ， CCoAOMT基因，和LDOX ）和萜类植物抗毒素的途径（ MVD ， EAS ， andVS ）的酶也诱导叶盘产生耐受性。通过这些酶产生的代谢产物，即东莨菪苷，木质素，木脂素，花青素，和倍半萜，一直主要牵涉到对病原体和UV的防御反应，其中不少也可以作

15、为抗氧化剂。 基因编码的叶绿体（ Ycf3 ， AGP）和线粒体（ UCP ，丕转运）蛋白的表达也受到MV预处理的影响，这表明对氧化应激的耐受性可能需要生理的适应。 Ycf3 mRNA编码一个与光系统相关的叶绿体蛋白质的水平下降，就如同mRNA编码的ADP -葡萄糖焦磷酸化酶（ AGP） 。光合作用相关基因的下调的可能会使光合作用推迟，其中多发生在胁迫条件下和从叶绿体电子传输链产生的AOS（烯基磺酸盐）。 光合作用一系列相关的基因的下调也在过氧化氢处理过的拟南芥细胞中观察到。在线粒体中，这是环境胁迫条件下AOS的重要来源， AOS的产生可通过线粒体呼吸链和膜电位解偶联的手段来抑制。在耐受性叶盘

16、中，增强了转录产物编码一个假定的线粒体解偶联蛋白（ UCP ）的能力。总之，这些数据表明，电子传递链的AOS形成的减少是植物适应氧化应激的另一种方式。 耐受性烟草叶盘中抗菌基因（ PRB1b ， CBP20 ，和Chitinase4 ）被诱导。从活性氧产生H2O2是感应识别这些病原体基因的信号，这可以解释为什么在诱导性耐受烟叶组织中存在H2O2。 生物和非生物胁迫产生的获得性免疫耐受性一般认为是驯化组织从生理适应及防卫基因和蛋白质的诱导造成的。大多数基因，包括抗氧化和细胞保护基因，不仅诱导驯化叶盘，在严重的氧化应激过程中也会增强驯化叶盘中的表达。即使在长期暴露在MV中，通过亚致死剂量的预处理的敏感植物表现出更强的基因诱导了。一些防御基因表达的增强作用已经在先前的胁迫或应激激素预处理中被观察到，认为这些基因造成了预处理的植物对生物和非生物胁迫产生耐受性。 在这里，我们已经表明，对氧化应激的耐受过程涉及不同组防御基因的协同增效。综合结果表明，应激调控通路迅速、高效的基因表达可能是造成耐受胁迫的基本要素之一。 亚致死浓度的MV预处理来敏化植物具有更高的基因表达，从而表明AOS（烯基磺酸盐）也可以增强基因的表达。 氧化