艾塞那肽长效缓释微球的制备及体内药效学研究

1、艾塞那肽长效缓释微球的制备及体内药效学研究刘斌1,2，董庆光1，王梦舒1，李纯1，孔维1,2，陈妍1*(1.吉林大学生命科学学院，长春 130012； 2.吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室，长春 130012.)摘要：目的 制备艾塞那肽长效缓释微球，并考察其理化性质、体外释放特性及体内药效学。方法 采用复乳溶剂挥发法（W/O/W）制备包裹艾塞那肽的聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA）微球；考察微球的粒径分布、表面形态、载药量和包封率； 用microBCA试剂盒测定微球的体外释放速率；考察了微球在糖尿病模型小鼠体内的降血糖作用。结果 微球外观光滑圆整，分散性好，艾塞那肽载药量为3，包封率为

2、75；微球40d之内体外累积释放达到88，其体外释放曲线近似零级释放模式；体内药效学实验结果显示，40d内微球组小鼠与模型对照组小鼠血糖相比具有显著性差异（P<0.05）。结论 采用复乳溶剂挥发法成功制备了可以缓释40d的艾塞那肽长效微球，且40d之内在糖尿病小鼠体内具有明显的降血糖作用。关键词：艾塞那肽；聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物；微球；血糖中图文类号： 文献标识码： 文章编号：Preparation of Long-acting Release Microspheres of Exenatide and Studies on Their in vivo Pharmacodynamics

3、LIU Bin1,2，DONG Qing-Guang1，WANG Meng-Shu1，LI Chun1，KONG Wei1,2，CHEN Yan1*（1. College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China； 2. State Key Laboratory of Supramolecular Structure & Materials, Jilin University, Changchun 130012.,China.）ABSTRACT: OBJECTIVE To prapere Exenatide l

4、oaded long-acting release microspheres, and to evaluate their physical and chemical characteristics、in vitro release behavior as well as in vivo pharmacodynamics. METHOD Exenatide loaded PLGA microspheres were prepared by double emulsion(W/O/W)method. The mean diameter、morphology、drug loading and en

5、capsulation efficiency were evaluated. The micro-BCA protein assay was used for the in vitro release behavior. The effect of reducing plasma glucose were evaluated on the diabetes mice. RESULTS The microspheres possessed smooth and round appearance as well as good dispersive quality. The drug loadin

6、g and encapsulation efficiency was 3% and 75%. The in vitro accumulated release within 40d reached up to 88%, and the release pro consistent with zero-class release model. The results of in vivo pharmacodynamics indicated that the plasma glucose of mice injected with Exenatide microspheres was diffe

7、rent significantly from the plasma glucose of the diabetes model mice within 40d (P<0.05). CONCLUSION The Exenatide loaded long-acting release microspheres which could yield 40d continuous release were prepared successfully by double emulsion method. The microspheres displayed significant appeara

8、nce of decreasing plasma glucose in the diabetes mice within 40d.KEY WORDS: Exenatide；poly ( lactide-co-glycolic acid)；microspheres；plasma glucose艾塞那肽（Exenatide）是Exendin-4的人工合成物，Exendin-4是美国西南部的大毒蜥在进食时所分泌唾液中的一种含有39 个氨基酸的多肽，分子式C184H282N50O60S，分子量4186.571。Exendin-4是胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物，与哺乳动物的GLP-1氨基酸序列具

9、有53%同源性2，是有效的GLP-1受体激动剂，具有葡萄糖依赖型控制血糖浓度、刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胰岛B细胞凋亡、减缓胃排空、减小食欲等生理活性35 ，适于2 型糖尿病的治疗。Exendin-4的这些生理活性与GLP-1相似6，但GLP-1在体内迅速的被二肽基肽酶IV（DPPIV）所降解，半衰期只有1-2分钟，会很快被清除7，而Exendin-4不易被DPPIV降解，对DPPIV的清除具有一定的抵抗作用，在体内循环的半衰期较长，可以达到60-90分钟8。目前，艾塞那肽用于治疗2 型糖尿病的研究已经越来越多，且其新药上市申请(NDA)已于2005年4月获美国FDA批准，用于改

10、善使用二甲双胍和磺酰脲类药物不理想的2 型糖尿病患者的血糖控制。临床结果显示，艾塞那肽用于糖尿病治疗效果明显9，且副反应较小，但是每天两次的皮下给药给病人带来很多不便，其缓释制剂则可以明显的提高病人的顺应性。本研究以可生物降解的聚合物PLGA为囊材，通过复乳溶剂挥发法成功制备了艾塞那肽PLGA长效缓释微球，并观察了其体外释放及体内降血糖作用。1 材料、仪器与动物 1.1 仪器MICCRA D-8高剪切力匀浆器（德国ART公司）；5810R冷冻型台式高速离心机（德国eppendorf公司）；XL30 ESEM FEG扫描电子显微镜（美国FEI公司）；Nano-ZS zetasizer动态光散射仪

11、（英国Malvern公司）；冷冻干燥机；ELX 800酶标分析仪(美国biorad公司)；三诺快速血糖测试仪。1.2 试剂艾塞那肽（长春百科生物科技有限公司提供,纯度99以上）；PLGA（乳酸/乙醇酸比率即L /G比为50 /50,固有黏度为0.37 dL·g- 1 ,Mw 38600）购于美国伯明翰公司；聚乙烯醇( PVA, Mw3万7万, Sigma公司)；叠氮钠购于Sigma公司；microBCA蛋白检测试剂盒购于pierce公司；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购于Sigma公司；二氯甲烷、SDS、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠等其他试剂均为分析纯。1.3 动物 昆

12、明小鼠，体重均在1820g，雌雄各半，购于吉林大学基础医学院动物实验中心。2 实验方法2.1 艾塞那肽PLGA微球的制备 参考文献报道10，采用复乳溶剂挥发法（W/O/W）制备艾塞那肽PLGA微球，制备工艺如下：称取一定量的艾塞那肽冻干粉，用醋酸钠溶液溶解作为内水相，与一定浓度PLGA的二氯甲烷溶液混合，用高速匀浆器搅拌制得初乳，快速滴加到1PVA水溶液中，匀浆器高速搅拌得到复乳，继续搅拌4h，离心收集微球，蒸馏水洗涤三次，冷冻干燥24h，即得。2.2 微球表征2.2.1 微球的形态、粒径大小和分布取艾塞那肽微球冻干粉适量, 均匀涂在双面胶带上,离子镀膜仪溅金，在XL30 ESEM FEG电子

13、扫描显微镜下观察微球的表面形貌。取微球混悬液适量，用蒸馏水稀释，用Nano-ZS zetasizer动态光散射仪测定粒径大小和分布。2.2.2 微球载药量和包封率的测定 采用文献中报道的NaOH-SDS法来测定微球的载药量和包封率10，具体操作如下：准确称量10mg微球，用1ml 0.1mol·L-1 NaOH（含5SDS）溶液混悬，在100rpm、37水浴摇床中震荡24h，8000rpm离心10min，取上清液，用microBCA试剂盒测定上清液中的艾塞那肽含量。 载药量% =微球中所含药物重量×100%微球的总重量微球的包封率% =微球的实际载药量×100%微

14、球的理论载药量2.3 微球的体外释放试验准确称量艾塞那肽微球20mg，混悬于10 mmol·L-1 pH 7.4磷酸盐缓冲液(含0.01%叠氮钠和5mmol·L-1 SDS), 置于玻璃离心管中，在水浴摇床中震荡,速度100rpm，温度37，每隔1d取出离心管于4000rpm离心10min,取出全部上清液, 用microBCA试剂盒测定上清液中艾塞那肽的含量。剩余微球加入全新的释放液继续在水浴摇床中震荡。2.4 糖尿病模型小鼠体内的药效学研究 2.4.1 动物分组及给药方法 将体重18-20g昆明小鼠随机分成4组，每组8只，雌雄各半，A组为空白对照组，B组为模型对照组，C组

15、为艾塞那肽水溶液实验组，D组为艾塞那肽微球实验组。A组、B组每天颈背部皮下注射生理盐水2次，早晚各一次；C组每天颈背部皮下注射艾塞那肽水溶液2次，每天3g·Kg1，早晚各一次；D组颈背部一次性皮下注射艾塞那肽微球5mg·Kg1，注射前微球先用混悬剂（3羧甲基纤维素钠0.1Tween20）混悬。B组、C、D从实验开始的第1天每天腹腔注射STZ 30mg/kg（0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液配置，pH5.0），连续7天，注射STZ前小鼠禁食12h。2.4.2 血糖测定 实验开始的第0、4、8、12、18、24、30、36、40天早上在注射艾塞那肽水溶液之前测定小鼠血

16、糖，测量之前小鼠禁食12h，尾静脉取血，用三诺血糖仪进行血糖测定，观察小鼠40d之内的血糖变化情况。在实验开始后的第20d，测定小鼠在早上给药后的16h内的血糖，每隔1h测定一次，给药前小鼠禁食12h，观察各组在给药后6h内的血糖变化情况。3 结果3.1 微球的理化性质 用复乳溶剂挥发法制备的艾塞那肽微球形态圆整，表面光滑，粒径分布均匀，扫描电镜照片见图1，微球的粒径分布见图2。微球载药量为3，包封率为75。 图1 艾塞那肽微球扫描电镜图Fig 1 SEM photographs of Exenatide loaded microspheres 图2 DLS测定的艾塞那肽微球粒径分布Fig 2

17、 The particle size distribution of Exenatide loaded microspheres determined by DLS.3.2 微球的体外释放 图3是艾塞那肽微球的体外释放曲线。微球在1d的突释为18，第225d释药稍缓慢，2540d释药稍快，40d累积释放达88。用线性回归的方法进行微球体外释放模型的拟合，结果显示其释放符合零级释放方程。图3 微球的体外累积释放Fig 3 In vitro release of Exennatide loaded microspheres3.3 艾塞那肽微球在糖尿病模型小鼠体内的降血糖作用 各组小鼠40d内的血糖

18、变化见图4。A组（空白对照）小鼠在40d内的血糖没有明显的变化；B组(模型对照)小鼠在注射STZ后血糖呈现明显的上升趋势，8d之后血糖稳定在 15mmol·L-1以上；C组(艾塞那肽水溶液)小鼠前8d的血糖呈逐渐上升趋势，8d之后血糖在 10mmol·L-1上下波动，且明显低于B组；D组(艾塞那肽微球)小鼠血糖变化趋势与C组基本相同，且与B组在40d之内具有显著性差异（P<0.05）。D组小鼠血糖在第40d明显上升，与B组已没有显著性差异；而C组小鼠的血糖第40d变化不大。图4 艾塞那肽微球注射后40d内小鼠的血糖变化 与模型对照组小鼠 *P<0.05, *P&

19、lt;0.01（n8）Fig 4 Changes of Plasma glucose level in mice after the injection of Exenatide loaded microspheres *P<0.05, *P<0.01 VS diabetes model control（n8）3.4 给药后6h内的血糖变化 为了观察艾塞那肽水溶液组小鼠给药后的血糖变化情况以及同一时间内微球组小鼠的血糖变化趋势，实验开始后第20d早上测定了给药后6h内的血糖变化，结果见图5。0时为给药之前测定的各组小鼠的空腹血糖（小鼠已禁食12h），此时C组和D组的血糖浓度相近。在

20、A、B组注射注射用水、C组注射艾塞那肽水溶液后1h，C组小鼠血糖显著降低，而D组小鼠血糖降低幅度较小，两组小鼠之间的血糖差异随着时间逐渐减小，6h时又达到同一水平。图5 第20d给药后6h内各组小鼠的血糖变化Fig 5 Changes of Plasma glucose level in mice of each group within 6h after the drug injection at the 20th day.4 讨论目前，艾塞那肽的上市产品为1 日2 次的注射剂，而其缓释制剂还没有产品上市。Lilly、Amylin 和Alkermes 3 家公司共同开发的exenatide

21、(Byetta) 的1周1次使用的长效缓释制剂用2 型糖尿病病人可安全有效地控制血糖，现正处于临床阶段。另外，Amylin公司研发的缓释时间更长的艾塞那肽长效缓释微球进行了大鼠在体实验，28d之内可以增强血糖控制11。 本研究采用复乳法成功的制备了可以缓释40d的艾塞那肽PLGA长效缓释微球。复乳法是目前制备多肽微球最常用的方法之一，具有工艺稳定、设备简单等特点。微球在体外能够稳定释药40d，第1d突释18，40d之内前期释放较缓慢，后期释放稍快，这是由PLGA微球的释放机制决定的。通常，药物从微球中释放是一个三相过程：突释相、扩散相和溶蚀相。突释相是由于微球表面和近表面的药物迅速扩散到释放介

22、质中而出现的；扩散相是水性介质从微球表面的孔洞进入微球内部，导致药物扩散释放；溶蚀相是聚合物骨架降解导致药物释放。本实验所制备的艾塞那肽微球表面光滑，表面没有孔洞，所以在前期扩散相阶段释放较慢。本实验采用腹腔注射STZ建立糖尿病模型，进行了小鼠体内的药效学研究。实验分别对比了空白对照组、糖尿病模型对照组、艾塞那肽水溶液组和艾塞那肽微球组小鼠40d内的血糖变化，结果显示，正常小鼠在40d内的空腹血糖一直维持在正常水平，一次性注射艾塞那肽微球的小鼠40d之内与每天两次皮下注射艾塞那肽水溶液的小鼠血糖变化基本一致，并与模型对照组具有显著性差异，说明艾塞那肽微球在小鼠体内可以稳定缓慢的释放艾塞那肽，4

23、0d之内具有明显的降血糖作用，且降血糖效果与每天两次皮下注射艾塞那肽水溶液基本一致。第20d早上给药后的6h的血糖测定结果显示，艾塞那肽水溶液组小鼠皮下给药后1h降糖效果最为显著，这与文献一致12，此时血糖明显低于艾塞那肽微球组小鼠，而后两组小鼠的血糖差异逐渐减小，6h与艾塞那肽微球组小鼠血糖相近；艾塞那肽微球组小鼠在6h内血糖变化较为平缓，没有大的波动，说明艾塞那肽从微球中缓慢释放，小鼠体内保持稳定的的艾塞那肽浓度。 体内外的结果显示，所制备的的艾塞那肽微球在40d之内的缓释作用明显。参考文献1. Eng J, Kleinman WA, Singh L et al. Isolation an

24、d characterization of exendin-4, an exendin-3 analogue, from Heloderma suspectum venomJ. J Biol Chem, 1992, 267: 7402-7405.2. Drucker DJ. Glucagon-like peptidesJ. Diabetes ,1998,47: 159 169.3. Nielsen LL, Young AA, Parkes DG. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4): a potential therapeutic f

25、or improved glycemic control of type 2 diabetesJ. Regul Pept, 2004,117: 77-88.4. Kolterman OG, Buse JB, Fineman MS, et al. Synthetic exendin-4 (exenatide) significantly reduces postprandial and fasting plasma glucose in subjects with type 2 diabetesJ. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88: 3082-3089.5.

26、Danny Soon, Prajakti A, Kothare, Helle Linnebjerg. Effect of Exenatide on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin in Healthy Asian MenJ. J Clin Pharmacol, 2006, 46: 1179-1187.6. MA Nauck. Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and incretin mimetics for the treatment of diabetesJ. Practical Di

27、abetes Int, 2005, 22(5): 171179.7. Gribble FM, Williams L, Simpson AK, Reimann F. A novel glucose sensing mechanism contributing to glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell lineJ. Diabetes , 2003, 52: 1147-1154. 8. Kolterman OG, Kim DD, Shen L, et al. Pharmacokinetics, pharmacodynami- cs, and safety of exenatide in patients w