小鼠肺腺癌动物模型的建立_赵振国

1、文章编号 : 1007-6611(2009 05-0408-03小鼠肺腺癌动物模型的建立赵振国 , 罗福康 , 辇伟奇 , 赵伟鹏 , 钱 莘 , 孙建国 , 段玉忠 , 朱 波 , 陈正堂 * (第三 军医大 学新桥医院全军肿瘤 研究所 , 重庆 400037; *通讯作者 , T e l E -m a i l :z h e n g t a n g c h e n ya h o o . c o m . c n 摘要 : 目的 通过建立小鼠肺腺癌动物模型 , 为下一步筛选肺腺 癌形成过 程中重要 m i R N A s 提供实 验平台 。 方法 采用 L o x

2、-s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠鼻腔吸入 A d C r e 重组腺病毒的方法建立 小鼠肺 腺癌模 型 , 以 分散酶 和 型 胶原酶 酶解消 化模型 小鼠肺组织为单细胞悬液并以 免疫荧光染色的 方法检 测其 C D 34、S c a -1的表达 情况 。 结果 通过 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠鼻腔滴入 A d C r e 成功建立 了小鼠肺腺癌模型 , 模型小鼠中 有 C D 34、S c a -1的表达 。 结论 成 功建立小鼠 肺腺癌 动物模 型 , 为后续筛选小鼠肺腺癌发展过程中重要 m i R N A

3、 提供了实验基础 。关键词 :A d C r e ; L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠 ; 肺腺癌 ; 动物模型中图分类号 :R 734. 2 文献标识码 :AE s t a b l i s h m e n t o f am o u s e m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m aZ H A OZ h e n -g u o , L U OF u -k a n g , N I A NWe i -q i , Z H A OW e i -p e n g , Q I A NS h

4、 e n , S U NJ i a n -g u o , D U A NY u -z h o n g , Z H UB o , C H E NZ h e n g -t a n g *(C a n c e r C e n t e r o f P L A , X i n q i a oH o s p i t a l , T h i r dM i l i t a r yM e d i c a l U n i v e r s i t y , C h o n g q i n g 400037, C h i n a ; *C o r r e s p o n d i n g a u t h o r , T

5、e l E -m a i l :z h e n g t a n g c h e n ya h o o . c o m . c n A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a i nm i c e , a n dt o s u p p l y a ne x p e r i m e n t p l a t f o r m f o r s c r e e no f i m p o

6、 r t a n t m i R N A s i n t h e p r o c e s s o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a . M e t h o d s T h e p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a m o d e l w a s e s t a b l i s h e db y i n t r a n a s a l a d m i n i s t r a t i o n o f a d e n o v i r u s C r e t o L o x -s t o

7、 p -l o x K -r a s G 12Dm i c e . T h e l u n g t i s s u e s o f m o d e l m i c e w e r e d i g e s t e d w i t h d i s p a s e a n d c o l l a g e n a s e i n c o m b i n a t i o n , a n dt h e nt h e e x p r e s s i o no f S c a -1a n d C D 34w a s d e t e c t e d b y t h e d u a l -c o l o r i

8、m m u n o f l u o r e s c e n c e . R e s u l t s T h e m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a w a s e s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y , a n d S c a -1a n dC D 34w e r e e x p r e s s e d i n t h e l u n g o f m o d e l m i c e . C o n c l u s i o n T h e m o d e l o

9、 f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a c a nb ee s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y f o r f u r t h e r s t u d yo n s c r e e no f i m p o r t a n t m i R N A s i n t h e p r o c e s s o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a .K e yw o r d s :A d C r e ; L o x -s t o p -l

10、 o x K -r a s G 12Dm i c e ; p u l m o n a r ya d e n o c a r c i n o m a ; a n i m a l m o d e l 肺腺癌是最常见的肺部恶性肿瘤 , 但是这种类型肿瘤细胞的细胞起源和进展还不完全清楚 , 近年来癌症干细胞学说是癌症生物学非常重要的进展 ,此理论不但提供了癌症生成的可能原因 , 更解释了癌症产生抗药性导致难以治愈的可能原因 , 成为了当前的研究 热点 1-4。 J a c k s o n 等 利用 重组 A d C r e 诱导小鼠肺组织 K -r a s G 12D 的表达来控制肺腺癌 的起始时限及

11、复杂性 , 为肺腺癌研究提供了良好的 动物模型 5。 K i m 等 3使用细胞表面标志从大鼠支气管肺泡 导管连接处分离出一群 S c a +C D 45-P e c a m -C D 34+细胞 , 命名 为 支气 管 肺泡 干 细胞 (b r o n c h i o a l v e o l a r s t e mc e l l s , B A S C s , 并发现 L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D m i c e D 转化的肺癌和这种双阳性细胞的增殖有关 ; 另外 , B A S C s 在不典型性增 生及肺腺癌 K -r a s 基因 突变活化的

12、终末支气管和肺泡上皮细胞中的数量明显增加 , 认为 B A S C s 可能是肺腺癌的起源细胞 。 目 前 , 我们也就肺腺癌干细胞展开了相关研究 , 首先利 用 A d C r e 重组腺病毒诱导 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠建立肺腺癌动物模型 , 并以直接免疫荧光的方 法检测了其 C D 34、S c a -1的表达情况 , 从而为后续干 细胞分选提供实验依据及实验平台 。1 材料与方法1. 1 材料 所用小鼠由人类癌症协会小鼠模型库(M o u s e M o d e l s o f H u m a nC a n c e r C o n s

13、 o r t i u m , M M H -C C 馈赠 , H E K 293(A m e r i c a nT y p eC u l t u r eC o l l e c -t i o n , c a t #C R L -1573 腺病毒的包装细胞由第三军医大学生物化学与分子生物学教研室馈赠 , A D C r e 重组腺病毒由 M i c r o b i x 公司提供 。1. 2 试剂 胎牛血清 (F B S 由上海微科生化试剂有限公司提供 , D M E M 由 G I B C O 公司提供 , 胰酶由上海化学试剂有限公司提供 , 分散酶 (美国 S i g m a 公 基金项目 :

14、国家高技术发展研究计划 (“ 863” 项目 (2008a a 02Z 104·408· 山西医科大学学报 (J S h a n x i M e d U n i v 2009年 5月 , 40(5 司 , 胶原酶 (瑞 士罗氏公司 , 组 织基因组 D N A 提取试剂盒 (B i o s p i n , T a q 酶 (2×P f u P C R M a s t e r -M i x , T I A N G E N 公司 , 硫氢酸荧光黄 (f l u o r e s c e i n i s o -t h i o c y a n a t e , F I T C

15、 标记大鼠抗小鼠 C D 34抗体 、 对照 抗体大鼠 I g G 1; 藻红蛋白 (p h y c o e r y t h r i n , P E 标记大 鼠抗小鼠 S c a -1抗体 (加拿大 S t e m C e l l 公司 , 对照 抗体 大鼠 I g G 2-P E (美 国 E b i o s c i e n c e 公 司 , D A P I (罗氏 公司 , A d e n o -X T M V i r u s P u r i f i c a t i o nK i t (B D B i o s c i e n c e s , C l o n t e c h 。1. 3 小

16、 鼠的鉴定 合成上游 引物 :5 -C C TT T A C A AG C GC A CG C AG A CT G TA G A-3 , 下游引物 : 5 -A G CT A GC C AC C AT G GC T TG A GT A A G T C T G CA-3 (引物由上海生工公司合成 ; 取小鼠脚 趾以研钵研碎后按照 B i o s p i n 组织基因组提取试剂 盒操作说明进行小鼠基因组的提取 ; 以小鼠的基因 组 D N A 为模板做 P C R , 其扩增参数为 :25l 总反应 体积 , 2l 抽提的小鼠基因组 D N A 为模板 , 94 变性 2m i n ; 然后以 9

17、4 30s , 60 1m i n , 68 2m i n 的程序循环 35次 , 68 延伸 10m i n 。 在 P C R 仪上 进行扩增 , 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 , 扩增基因片 段预期为 550b p 含 L o x P 的序列 。1. 4A d C r e 重组病毒的 扩增与纯化 将 1个 T 25细胞培养瓶中生长状态良好的 H E K 293细胞 4倍稀 释后传入另一个 T 25细胞培养瓶中 , 以含 10%F B S 的 D M E M 培养液在 37, 5%CO 2下培养 (以下扩增 中均使用此条件培养细胞 。 待细胞达到 60%汇合 时 , 向培养瓶中加入腺病毒毒种

18、, 将培养瓶置于细胞 培养箱中继续培养 。 待大部分细胞出现典型的细胞 病变效应 (C P E , 且有 50%的细胞 脱壁时 , 低速离 心收集细胞并重悬于 2m l P B S 中 , -70 /37 反 复冻融 、 振荡 3次 , 于 4, 7000×g 离心 5m i n , 收 集病毒 上清 于 -70 保 存 。 按 A d e n o -X T M V i r u s P u r i f i c a t i o n K i t 的步骤 6纯化重组腺病毒 。1. 5 小鼠肺腺癌动物模型的建立 先以戊巴比妥 钠 45m g /kg 腹腔注射麻醉 3周龄小鼠 , 再以 A d

19、 C r e : C a P i (A d C r e :C a P i :滴度为 2. 5×107p f u 的 A d C r e 50l 加入到 69l 的 M E M 中 , 再加入 6l 的 2. 5m o l /L的氯化钙 的共沉淀物滴入小鼠的 鼻腔 , 共滴入约 125l , 分 2次滴入 , 隔 5d 后重复滴入 , 重复 2次 , 共 30d ; 分别在诱导后 7d , 20d , 30d 处死小鼠取其 肺组织进行石蜡包埋 、 切片 、H E 染色 。1. 6 直接免疫荧光检测小鼠肺腺癌模型中 C D 34、 1, 成 1m m 3大小的碎块 , P B S 反复漂

20、洗去除红细胞 , 加 入 0. 25%Di s p a s e 1. 5m l 、 0. 4%胶原酶 0. 5m l 、 50l 新生牛血清 (F C S 消化 , 4 过夜 12-16h , 再置于 37 孵箱中消化 50-60m i n ; 400目尼龙筛网过滤 , 5%F C S 的 P B S 悬浮细胞 ; 1000r /mi n 离心 5m i n , 调整细胞数为 106/100l , 入分别为 1 16的荧光抗 体 F I T C -C D 34、 P E -S c a -1抗 体 37 共 同 孵 育 15 m i n , p H 7. 2P B S 中洗 2次 , 搅拌 ,

21、每次 5m i n , 再用蒸 馏水洗 1m i n , 除去盐结晶 ; 然后加入 D A P I 工作液 37 孵育 15m i n , 漂洗后在激光共聚焦显微镜下观察 。 1. 7 统计学分析 采用 S P S S 11. 0统计软件包对数 据进行分析 , 两组间比较采用 t -t e s t 检验 , 结果均以 双侧 P<0. 05为差异有统计学意义 。2 结果2. 1 小鼠的鉴定 以小鼠的基因组 D N A 为模板进 行 P C R 可扩增得到 550b p 含 L o x P 的序列 , 证明小 鼠为 L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小

22、鼠 , 见图 1, 2。1. D N AM a r k e r ; 2. L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠基因组 D N A 图 1 小鼠基因组 D N A 提取F i g 1T h e g e n o m e D N Ao f L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12Dm o u s e1. M a r k e r ; 2, 3. L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠图 2 基因组 D N AP C R 结果F Rr e s u l t o f o u s e e n o e

23、D N A·409· 山西医科大学学报 (J S h a n x i M e d U n i v 2009年 5月 , 40(5 2. 2A d C r e 重组腺病毒扩增及纯化结果 A d C r e 重 组腺病毒感染 293细胞 3d , 293细胞开始出现病变 效应 (C P E , 感染 7d , 293细胞出现明显病变效应 , 感染 9d 后 293细胞开始脱落 , 释放病毒颗粒 , 见图 3(见第 478页 。 A d C r e 重组腺病毒感染 293细胞 96h 后即可观察出现 C P E , 并随 C P E 逐渐增强 , 同 时细胞逐渐由贴壁状态转为悬浮

24、 , 此过程约 9d 。 2. 3 小 鼠动 物 模 型 的 建 立 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠在鼻腔吸入 A d C r e 1周后细支气管出现 肺支气管上皮增生 ; 20d 后细支气管出现肺支气管 上皮非典型性增生 ; 30d 后不仅出现肺支气管非典 型性上皮增生 , 而且旁边出现癌巢 (见图 4, 见第 478页 。 2. 4 直接免疫荧光检测小鼠肺腺癌模型中 C D 34、 S c a -1的表达 L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠经过鼻 腔吸入 A d C r e 后 , 肺组织细胞中有 C

25、 D 34、S c a -1双阳 性细胞 (见图 5, 见第 478页 。 3 讨论 条件性基因敲除鼠肺腺癌模型有利于对肺腺癌 的起始和早期有更清楚的了解 , 并且可以控制癌肿 发生的时间和大小 , 但是无法控制肿瘤的数量 。 可 以通过控制给予重组 C R E 病毒的剂量来实现对于 肿瘤发生的时间和大小的控制 , 而且这样的模型与 人肺癌的起始发生非常接近 , 而且使用重组 C R E 病 毒诱导 K -r a s G 12D 的表达与肿瘤的发生同步进行 , 这样可以通过组织学改变来跟踪肿瘤的进展 。 不能 排除腺病毒在肿瘤发生过程中具有一定的作用 , 但 是根据报道 , 给予野生型小鼠大剂

26、量的重组病毒后 并没有产生过度增生的迹象 5。 根据 K i m 等 3报 道 , 小 鼠 肺 细 胞中 S c a -1+C D 34+C D 31-C D 45-细胞为肺内支气管肺泡干细 胞 (B A S C , 此类细胞的恶性转化是肺 腺癌发生的 主要原因 。 肿瘤干细胞 (c a n c e r s t e m c e l l s , C S C s 7是指肿瘤组织中少数具有无限增殖潜能 、 自我更新 、 分化潜能的细胞 。 此外 , 癌干细胞还具有对化疗药 物的耐药性和高致瘤性 。 许多学者提出癌症干细胞 假说 , 指出癌症干细胞起源于正常干细胞遗传突变 的积累 。 肿瘤起源于组织干

27、细胞 , 或者是组织干细 胞的子代 ; 正常情况下 , 这些细胞的自我更新受严格 调控 , 但在发生恶性转化后 , 自我更新的调控机制发 生紊乱 , 发生恶性转化形成的癌症干细胞仍保留有 自我更新 、 驱动肿瘤的形成和维持肿瘤的存在 , 癌症 干细胞分化后产生的肿瘤细胞不具备成瘤性 , 但这 些分化细胞组成了肿瘤的主体 。 我们成功建立了小 鼠肺腺癌的 动物 模型 , 并 且 检测 了模 型中 S c a -1, C D 34的表达 , 为进一步比较小鼠诱导前后此标记细 胞的相干生物学特性创造了实验平台 。参考文献 :1Z h a n gM , R o s e nJ M . S t e m c

28、 e l l si nt h ee t i o l o g ya n dt r e a t m e n t o fc a n c e r J . C u r r O p i n G e n e t D e v , 2006, 16(1 :60-64.2G r i f f i t h s M J , B o n n e t D , J a n e s S M. S t e mc e l l s o f t h e a l v e o l a r e p i t h e -l i u m J . L a n c e t , 2005, 366(9481 :249-260.3K i m C F , J a c k s o n E L , W o o l f e n d e nA E , e t a l . I d e n t i f i c a t i o no f b r o n -c h i o a l v e o l a r s t e mc e l l s i nn o r m a l l u n g a n dl u n g c a n c e r J . C e l l , 2005, 121:823-835.4 D o n gJ , K i s l i n g e r T , J u r i s i c aI , e t a l . L