肝纤维化血清学诊断方法的研究进展_文献综述_

1、肝纤维化血清学诊断方法的研究进展(文献综述冯新利* 徐贵平 欧阳艳*肝纤维化是一个慢性的渐进性的过程,其改变程度对慢性肝病的预后判断、选择抗肝纤维化药物及快捷方便地对其疗效进行科学评价有重要意义,目前采用的诊断方法主要包括影像学诊断、病理诊断和血清学诊断三种。影像学诊断,主要是B超和C T,在临床应用广泛,但只能在肝纤维化晚期,发生肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图象,不能作出早期诊断。肝纤维化的诊断金指标虽是肝组织活检,但其本身也存在许多问题,如肝穿刺的盲目性,取材不够,肝脏病变的不均一性而导致的取样误差;虽属于微创检查,但多数患者仍有顾虑不愿接受,且不能反复取材进行动态观察。现在还没有一种

2、可靠的办法确定肝组织胶原含量,仅根据肝内纤维增生程度进行估计还需进一步将肝纤维组织量化1。血清学诊断是目前应用最广泛的肝纤维化诊断方法。取材方便,价格低廉,可早期诊断。血清学指标包括细胞外基质(E xtracellular Matrix,ECM成分、胶原酶类和细胞因子三大类,以ECM成分较为常用。一、EC M成分:(一 型前胶原(procollagen ,PC 和 型前胶原肽(procollagen type aminoterminal propetide,P P:PC 为 型胶原的前体,在肝脏主要由肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC合成,并释放在细胞外,PC

3、在向 型胶原转化的过程中,其氨基末端和羧基末端的肽被特殊的酶所裂解,主链再交联形成 型胶原,裂解下来的氨基末端肽即为 型前胶原肽P P。因此,测定肝病患者血清中的PC 含量可反映 型胶原的代谢及肝纤维化的程度。1979年Rohde等首先建立了血清P P的放免法,国内外学者目前多数认为P P是诊断肝纤维化的较好指标,但该放免试剂盒的抗原取材于动物胎皮,价格十分昂贵,且P P是PC 的降解产物,近年来,不少学者认为,肝脏炎症或坏死可使血清P P明显升高,不一定反映肝纤维化。Galambos等于1985年建立了PC 放免测定法,研究发现,随着肝纤维化的进展,血清PC 水平递增,提示PC 与P P有着

4、同样的临床意义2。1992年,李伟道等从人胎皮层中提取抗原制成试剂盒,提高了结果的准确性。国内叶红军等应用此试剂盒测定结果显示PC 含量与肝损伤炎症无关,比P P有更多的可靠性3。在肝纤维化的早期PC 合成较活跃,但晚期合成减慢,故PC 水平下降,因而PC 作为肝纤维化的程度的指标尚不够敏感,它只能作为活动性纤维化指标4。(二 型胶原(collagen type ,C :C 是由内皮细胞合成的,是构成基底膜的主要结构成分。正常肝小叶Disse 间隙缺乏基底膜,C 含量级微,且可能独立分布,肝纤维化* 西安交通大学第一医院核医学科(710061西安交通大学第一医院影像中心(710061早期即可见

5、其增生,最后与持续沉积的LN形成完整的基底膜,即所谓 肝窦毛细血管化 特征性表现。Obata K等通过动物实验显示,C 是最先增生的胶原,且转换率快,并发现血清C 浓度与肝纤维化程度有相关性5。C 是以原胶原形式交联组成的三维网状结构,含有C 的主三螺旋区(TH,也含有其氨基端的四聚体(7S片段和羧基端的二聚体(P CP,故测定血清7S片段、P CP或TH含量,能反映C 降解的情况。有报道7S片段对判断肝硬化的敏感性为79%,特异性为82%,并认为是反映病毒性肝炎肝纤维化程度最有价值的指标6。Kokko等报道肝纤维化大鼠早期血清中7S片段明显升高,并与C 的mRNA增高趋势相平行,而P P变化

6、不明显,提示C 合成增多是肝纤维化的早期表现之一7。(三透明质酸(hyaluronic acid,HA:肝脏是摄取和降解HA的主要场所,肝病患者由于枯否细胞合成HA增加,内皮细胞受损,数量减少及门脉短路,对HA降解不足,以致血清中HA水平升高,因此,HA水平可反映肝纤维化的程度。1985年,Laurent等首先报道肝硬化患者血清HA含量明显升高,其升高程度与组织学病变程度密切相关。有报道用HA 诊断肝硬化的敏感性为87%,特异性为93%,诊断率为90%。随着肝纤维化程度的进展,HA升高的绝对值和阳性率也增高,并与组织学病变的严重程度呈正相关8。(四层粘连蛋白(LN:LN是一种细胞外基质非胶原糖

7、蛋白,正常肝组织中LN含量很少,主要分布于血管壁、胆管壁及淋巴管壁等部位。肝纤维化进展过程中,它可以与其他ECM中成分交联,形成基底膜样结构,使肝窦毛细血管化,故此指标可反映肝窦毛细血管化和汇管区纤维化。LN随着肝纤维化的进展而合成增加,并能调节细胞生长和分化,除影响肝细胞营养外,还产生门脉高压。LN也是反映肝纤维化晚期的良好指标,且在侧枝循环建立后仍继续升高,不受肝功能的影响4。Kropf等报道,LN升高对肝纤维化的诊断敏感性为83%,特异性为98%,诊断率为92%,对肝硬化的诊断则分别为91%,98%和96%。高峰等发现,在用CCl4诱导大鼠肝脏损伤的急性期时,血清LN含量即开始明显高于正

8、常对照组,并随着肝功能和肝组织损伤程度的加重而递增,在肝硬化形成时达高峰,表明血清LN水平能反映肝脏的早期损害和肝组织病变的活动进程,对预示肝纤维化的发生和肝硬化早期诊断有重要价值9。(五纤维连接蛋白(FN:FN以细胞型和血浆型两种形式存在于体内,在肝外所有细胞外间隙均可测出。肝炎后肝硬化患者,血浆FN含量显著降低,病情越重,其值降低越明显9。Naveau等随访发现随着肝硬化严重程度的增加,血清FN值降低。FN>165mg/L者平均1年存活率为84%,而FN <165mg/L者平均1年存活率为53%(p<0 001,即FN下降111放射免疫学杂志2003年第16卷第2期预示着

9、肝硬化程度增加。在CCl 4诱导的急性肝损伤中,细胞型FN 在小叶中央附近的一些坏死部位沉积,而在多次CCl 4作用引起肝纤维化后,细胞型FN 沉积主要集中于纤维化间隔中。原位杂交表明,急性肝损伤细胞型FN 主要在靠近小叶中央的一些损伤组织中表达,纤维化形成中,其转录产物在靠近纤维间隔的周围合成,并且主要由肝脏间质细胞在局部产生10。二、胶原酶类:(一脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase,PH:它是胶原纤维合成的重要酶,由 、 两个亚单位构成四聚体,其活性与纤维生成的刺激有关,肝细胞损伤之后而胶原增生以前,其活性升高最明显。肝硬化患者的肝脏中PH 含量明显升高,但在血中测PH 活

10、性有困难,因为其有活性的四聚体不到10%,且血中存在的抑制物,PH 分子中 亚单位易分解, 亚单位较稳定,应用夹心酶联方法测定血清免疫反应性PH 分子中 亚单位,证明其含量与肝纤维化程度有关。(二脯氨酸肽酶(prolinase,PLD:它是体内广泛存在的一种蛋白水解酶,能水解氨基酸羧基末端含有脯氨酸或羟脯氨酸的多肽,与胶原蛋白降解密切相关,是反映胶原蛋白分解代谢的重要生化指标11。有报道,肝硬化时,PLD 升高与肝细胞急性损伤关系不大,与肝纤维化有关,也有相反意见。但目前较多认为PLD 与炎症和纤维化都有关。在肝炎时与ALT 同时升高,可能与炎症、坏死有关,在肝硬化时PLD 增高而ALT 正常

11、,则可能与肝纤维化有关。其诊断肝硬化的敏感性达90%,但特异性仅60%2。但是原肽只是存留在沉积的原纤维原分子上,血清中的原肽可能反映其在细胞外的裂解而不是从沉积中释放,当肝内有广泛炎症时,降解基质的基质金属蛋白酶活性可能很高,因而原胶原肽的血清水平也可能很高。(三金属蛋白酶(MMPs:是一类具有Zn2+依赖的内源性蛋白酶,组织修复、纤维化及癌浸润和转移有密切关系,能降解多种EC M 成分。目前已发现该酶有17个成员,在肝脏,MMPs 的主要来源细胞是激活的HSC,合成MMP -1、MMP-2、MMP-3等参与肝内EC M 的降解。MMP -1即组织胶原酶,可使间质胶原酶纤维在距氨基末端3/4

12、处裂成两段,降解胶原纤维,可预防结缔组织在肝脏中的沉积,而一些破坏基底膜样结构的胶原酶如MMP -2、MMP-9可降解正常肝脏结缔组织,破坏小叶排列,影响细胞与基质、细胞与细胞之间的正常关系而加剧肝纤维化。在肝纤维化早期,可以在肝内检测到MMP-1活性逐渐升高,降解胶原纤维,以对抗纤维化,到中晚期其活性逐渐降低,ECM 降解水平也明显下降12。(四金属蛋白酶组织抑制因子(T IMPs:为MMPs 的特异性抑制因子,Morthern 印迹法表明,原代培养的HSC 激活后能够合成TIMP-1与TIMP-2,在原发性胆汁性肝硬化患者,肝内TIMP-1与TIMP-2水平是正常肝内的25倍,纤维化肝脏内

13、TIMPs 多肽含量是正常肝脏的37倍13。三、细胞因子类:(一转化生长因子 1(TGF- 1:它是迄今为止发现的最强的EC M 沉积促进剂,能作用于多个环节,包括上调基质成分的转录、翻译和翻译后的步骤,促进基质蛋白和受体的产生,减少MMPs 的合成及增加TIMPs 的生成。用胸腺细胞增殖抑制法可测定TGF- 1的生物活性,用PCR 法可测定肝组织中TGF- 1mRNA 水平,慢性肝病患者肝组织中含量为正常对照的200倍,随着肝纤维化程度的加深,TGF- 1在肝组织中的表达逐渐增加,血清水平升高14。(二血小板源性生长因子(PDGF:主要由血小板、肝窦内皮细胞、枯否细胞等分泌,它由A 、B 两

14、个亚单位构成,形成AA 、AB 和BB 三种双聚体。目前认为主要是PDGF-BB 起作用。PDGF 能促进HSC 和肌成纤维细胞增殖及DNA 合成,抑制胶原降解,其作用可被PDGF 抗体所阻断15。(三肿瘤坏死因子 (TNF- :主要是由单核巨噬细胞/枯否细胞产生,可以用结晶紫染色来测定其生物活性。有人用TGF- 处理培养的大鼠HSC,发现24小时内胶原含量增加3倍以上,蛋白多糖增加2 6倍,但不伴有 型胶原RNA 水平增高,说明TNF- 对胶原合成的影响发生在翻译或翻译后水平15。目前,研究细胞因子检测对诊断肝纤维化的意义还刚刚起步,很多结果也不一致,而且由于肝炎和慢性肝病患者以及其他组织器

15、官疾病患者血清中细胞因子水平均可能增高,作为检测指标往往缺乏特异性,因此很少应用于临床。结语 在对以上这些血清标志物解释时须考虑以下问题。 这些物质的肝内含量仅是整个体内含量的一小部分,不能将来自肝脏的与来自其他脏器的基质区别; 当肝内有广泛炎症时,基质的降解也可增强,因而血清水平也增高; 肝脏疾病伴有胆道排泄障碍时,血清原肽水平增高; 血窦内皮细胞摄取基质分子,可能是重要的清除方式,因而内皮细胞功能受损时,血清原肽水平也可能升高; 在静止期肝硬化,如无活动性基质沉积,也可无血清标志物的异常。因此,寻找特异性强的血清学指标,以及诊断标准仍是今后努力的方向,同时,血清标志物的检测并不能取代肝组织

16、活检。参考文献1李伟道。肝纤维化研究工作中组织学量化值得重视。中华消化杂志1996;16(5:2492白石山、李秀霞、杨守昌,等。血清透明质酸、 型前胶原、板层素及脯氨酸肽酶水平与肝纤维化的关系。中华肝脏病杂志1997;5(2:723叶红军、高永生、王丽英,等。血清 型前胶原对肝纤维化的诊断价值。临床肝胆病杂志1993;(92:924王静艳、高红、王兆荃,等。 型前胶原层粘连蛋白在肝纤维化诊断中的意义。中国医科大学学报1997;26(2:1775Obata K,Twata T,Tnoue K,et al.One s tep sandwich enzyme i m -munoas say for

17、 human type collagen usi ng monodonalantibodies.Clin Di m Acta 1989;181:2936柴明胜。肝病诊断新标志 血清 型胶原。上海医学检验杂志1995;10(3:1827Kokko LA,Gunzler V,Hock JB,et al.Hepatic fibrosis i n rats produced112 放射免疫学杂志2003年第16卷第2期by carbon tetrachloride and dimethylnitrosami ne:Observations suggesting i m-munoass ays of s

18、erum for the7s fragment of type collagen are more sensi tive i ndex of liver damage than i mmunoassays for the NH2-terminal propetide of type procollagen.Hepatology1992;16:1678侯振江、张宗英、周秀梅。蛋白标记物在肝纤维化研究中的应用。中华肝脏病杂志1998;14(4:2009高峰、孔宪涛、谢映华,等。层粘蛋白于肝硬化的动物实验研究。临床肝胆病杂志1995;11(1:3410Odenthal M,Neubaner K,Ra

19、madori G,et al.Localization and mRNA steady-s tate level of cell ular fibronectin i n rat li ver undergoing a CCl4-i n-duced acute damage or fibrosis.Biochim Bi ophys Ac ta1993;1181(3:266 11何云、王建宾、王宇明。慢性肝炎肝纤维化程度诊断方法的进展。世界华人消化杂志2001;9(11:130512Arthur MJ P.Degration of matrix protei ns i n liver fibro

20、sis.Pathol Res Pract1994;190:82513Benyon RC,Iredale JP,Goddard S,et al.Expression of tis sue i nhi bitor of metall oproteinase1and2is increased i n fibrotic human li ver.Gas troen-terology1996;110:82114Okuno M,Mori waki H,Imai S.Retinoid exacer bate rat liver fibrosis by inducing the activati on of

21、latent TGF beta in liver stell ate cells.Hepatology 1997;26:91315陈晓红、何有成、姚集鲁。细胞因子对肝纤维化形成的影响。国外医学内科学分册2001;28(1:21(2003年1月10日收稿188Re标记单克隆抗体的应用研究进展*(文献综述第一军医大学南方医院核医学科(510515 李贵平 张 辉放免治疗(Radioimmunotherapy,RIT是一种新型的治疗方法,其基本原理是将针对肿瘤相关抗原的放射性标记单抗注射到肿瘤病人体内,利用抗体作为放射性核素的载体将 辐射导向肿瘤部位,来达到选择性破坏肿瘤的目的。目前已用于多种肿瘤的

22、治疗,包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌和淋巴瘤等恶性肿瘤,RIT尤其适于手术无法切除的肿瘤、早期复发肿瘤和远处转移瘤。RIT的效果取决于肿瘤组织接受的辐射剂量(cGy以及核素在肿瘤内滞留的时间。与药物和毒素不同,放射性标记抗体不仅可以杀死抗原表达阳性的肿瘤细胞,而且对附近抗原表达阴性的肿瘤细胞也具有杀伤作用。因此,RIT较体外放射治疗具有更高的选择性和特异性。虽然RIT仍处在发展阶段,但初步临床试验结果令人满意13。在近十年中,RIT已有多个项目进入 期临床试验。在血液系统恶性肿瘤中,RIT疗效最佳者首推何杰金和非何杰金淋巴细胞瘤4,5,对B细胞淋巴瘤的有效率已达70%80%,完全缓

23、解率达35%40%;所采用的单抗品种有Lym-1、抗CD20抗体及抗独特型抗体等。采用CD33、CD45、CD66、T101、Lym-1、IL-2受体、抗铁蛋白抗体等单抗或多抗治疗白血病及皮肤T-细胞淋巴瘤等其它血液系恶性病变。RIT既可以单独用于血液系统疾病的治疗也可结合化疗或全身放疗作为干细胞移植的前期治疗。在复发或难治的B细胞性非何金杰淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病中疗效肯定,毒性反应低,优于其他的治疗方法6,7。而在实体肿瘤中,对不能切除的肝癌主要采用抗-AFP或抗铁蛋白两种抗体,248例的总有效率为41%,其中12%转变为可切除肝癌,其余生存期延长至12 24个月8。对胆道癌、胃癌及结肠癌等多采用抗-CE A抗体9;神经母细胞瘤及胶质细胞瘤等采用抗-EGF、BC2等单抗;黑色素瘤采用识别P97的单抗;乳腺癌采用嵌合2G3抗体等10。与血液系统恶性肿瘤相比较,在实体肿瘤中所取得的疗效较为有限,这是由于RIT治疗所释放至肿瘤的放射性剂量通常太低。用于临床肿瘤放免治疗的放射性核素应具备适当的射程和一定能量的 射线,能特异性地杀死肿瘤细胞,同时又不伤害远处的正常细胞。而长期普遍使用的131I现已证实其物理和生物学特性均不理想,主要是标记抗体体内的脱碘、 射线能量较高、半衰期较长以及 射