家族性帕金森病的基因研究进展综述

1、 关联，但是硝化-synuclein在帕金森病的病变发展中所处地位尚未确实。 为明确硝化-synuclein与多巴胺神经元凋亡之间关系，本研究采用穿膜肽融合蛋白 和硝化技术将硝化-synuclein直接作用于多巴胺能神经元，以探讨帕金森病的病理机 制。通过体外和在体的一系列实验，我们得到了以下结果： 实验结果 硝基化-synuclein的制备和鉴定 通过体外构建质粒，融合表达，体外硝化的方式，得到了硝化修饰的融合蛋白N-SYN (硝化TAT-HA-synuclein，经考马斯亮蓝R-250染色、抗HA抗体作Western斑点 印迹确定产物为融合全长蛋白。抗硝化酪氨酸抗体作Western斑点印迹

2、确定经SIN-1处 理SYN被硝化为N-SYN。通过MALDI-TOF/TOF质谱进一步鉴定出N-SYN序列中三 个酪氨酸位点均被硝基化。 体外实验检测硝化TAT-HA-synuclein穿膜能力 将人源性多巴胺能神经细胞系SHSY-SY与不同浓度N-SYN和SYN(0.1M-1M 孵育，发现TAT肽段易化不同浓度N-SYN和SYN进入SHSY-5Y细胞胞浆中。硝化 不影响N-SYN蛋白入胞。 体外实验显示硝化-synuclein可诱导神经毒性 细胞毒性检测的乳酸脱氢酶释放实验显示，在低浓度(0.1至0.5 M时N-SYN 不会导致SHSY-5Y细胞LDH释放增加。但是在1M N-SYN孵育2

3、4小时内，SHSY-5Y 细胞LDH释放明显增加，显示高浓度情况下，N-SYN有明显细胞毒性。 SHSY-5Y细胞被暴露于序列中不含TAT的硝化-synuclein中未见LDH明显增加， 提示细胞内而非细胞外N-SYN对多巴胺神经细胞发挥毒性作用。考虑到硝基自由基可 以穿过细胞膜，结果排除了这种细胞毒性是由于存在于N-SYN溶液中的反应性硝基自 由基引起的可能性。 N-SYN诱导多巴胺能细胞凋亡呈剂量依赖性 将暴露于SYN和N-SYN的SHSY-5Y细胞行TUNEL检测其细胞凋亡显示，凋亡 细胞在0.5MN-SYN应用5小时后数量明显增加。同N-GFP处理组相比，1MN-SYN 引起超过两倍的

4、细胞凋亡率。虽然1M SYN同样引起细胞死亡，相同浓度下N-SYN毒 性更强。应用抗HA抗体免疫染色合并TUNEL观察蛋白凝聚和细胞凋亡之间关系，结 果显示两者关联尚不明确。 硝化-synuclein诱导原代中脑腹侧多巴胺神经元死亡 原代中脑腹侧神经元暴露于N-SYN48小时后行TH阳性神经元计数统计发现，高 浓度的N-SYN(5、10M无选择性地导致大部分细胞死亡。低浓度N-SYN导致多巴 胺神经元明显减少并呈剂量依赖性。同N-GFP组对比，0.1，0.5和1 M N-SYN分别导 致多巴胺神经元减少至73.6±3.0，32.0±2.0和22.2±3.3(p0.

5、01。0.5M和1 M SYN同样导致DA神经元减少，但毒性明显小于N-SYN(分别为对照水平的89.6±4.1， 83.1±5.5和71.6±4.1。 N-SYN诱导中脑黑质多巴胺神经元死亡 检测明确N-SYN及对照组蛋白可以成功导入到成年大鼠单侧中脑黑质致密部。单 次注射2l 6-OHDA(8/L分别导致注射后5周、11周大鼠注射侧TH阳性神经元减 少67.6±1.5和69.3±3.0。每天注射2LN-GFP两周，术后5、11周观察未见中脑黑 质致密部TH阳性神经元明显减少。每天注射2LSYN(20mol/L两周，在术后5、 11周中脑黑质

6、致密部TH阳性神经元分别减少13.4±5.4和14.5±7.7。每天注射 2LN-SYN(20mol/L两周，术后5、11周中脑黑质致密部TH阳性神经元分别减少 34.5±3.0和48.7±4.1。急性暴露于硝化-synuclein对成年大鼠中脑黑质致密部多巴胺 神经元有长期进展性毒性作用。 对N-SYN组冰冻切片的双侧中脑进行Nissl阳性和TH阳性神经元数目统计并作关 联度分析，显示TH阳性神经元数目，而非TH阴性神经元数目同Nissl阳性神经元数目 关联度大：术后5周TH阳性神经元同Nissl阳性神经元的相关系数0.825，TH阴性神 经元同Nis

7、sl阳性神经元的相关系数0.121；术后11周TH阳性神经元同Nissl阳性神经 元的相关系数0.915，TH阴性神经元同Nissl阳性神经元的相关系数0.660。统计结果进 一步明确TH阳性神经元减少缘于正常完整的神经元的减少而非TH本身表达水平的简 单下调。同时表明在N-SYN注射后对侧中脑黑质致密部的多巴胺神经元未受到明显毒 性作用。 同多巴胺神经元相邻的位于中脑黑质网状部的GABA能神经元以及腹侧背盖区的 多巴胺神经元在连续给予两周N-SYN注射后未见异常。进一步说明了中脑黑质致密部 多巴胺神经元对于N-SYN的特异易感性。 SYN和N-SYN胞内聚集同样导致-synuclein阳性、

8、Thioflavin-T阳性的异常凝聚 体形成。 N-SYN注射组术后5周大鼠中脑黑质小胶质细胞和星型胶质细胞 激活 N-SYN注射组腹侧中脑冠状面切片显示，与对照侧相比，注射侧中脑黑质多巴胺 神经元减少并可见残留多巴胺神经元周围活化小胶质细胞增加。定量分析显示N-SYN 注射侧Iba-1阳性小胶质细胞多于非注射侧(注射侧66.5±9.9/mm2，非注射侧 21.5±3.8/mm2，p0.01。抗GFAP免疫染色显示N-SYN组中注射侧GFAP表达水平为对 照侧的2.7±0.5倍(P0.01。结论：小胶质细胞和星型胶质细胞在N-SYN注射组术后 5周大鼠中脑黑质部

9、位均出现活化。 N-SYN处理组大鼠在开场实验中表现出自主活动减少 N-SYN处理组、SYN处理组、N-GFP处理组大鼠分别进行了开场实验，统计了15分 钟内的总运动路程、中心区域运动路程、周围区域运动路程。同N-GFP处理组对比， N-SYN处理组上述三个参数均减小50以上(产0.05。N-SYN组总活动时间在三组中最 少。在排除大鼠运动路程减少源于运动速度减小因素后，可以认为N-SYN导致大鼠自主 运动减少这一帕金森病的常见特征，很可能是由于黑质纹状体功能障碍引起的。 N-SYN处理组大鼠在转棒实验中表现出运动协调能力下降 为检测N-SYN组大鼠是否有运动协调能力障碍，N-SYN组大鼠进行

10、了转棒试验， 以大鼠转棒上停留时间和大鼠掉落前转棒的最大速度作为检测参数。同N-GFP组及SYN 组对比，N-SYN组大鼠在整个观察时间段内棒上停留时间和转棒最大速度均明显减小， 提示N-SYN处理导致大鼠运动协调能力和平衡能力损害。 N-SYN组大鼠在转圈实验中表现出运动不对称性 术后两周开始，N-SYN处理组和6-OHDA处理组大鼠在阿朴吗啡诱导下均出现单 侧旋转运动。同6-OHDA组表现出向手术对侧旋转相反，N-SYN处理导致大鼠表现同 侧持续性旋转运动，提示N-SYN引起单侧黑质纹状体多巴胺通路不可逆损伤，硝化 -synuclein对于黑质纹状体系统有明显毒性作用。 N-SYN处理组大

11、鼠纹状体中多巴胺受体2型下调，多巴胺含量下 降 为了探究N-SYN组大鼠在阿朴吗啡诱导下旋转行为的机制，术后5周我们采用免 疫组化方法检测双侧纹状体D2R水平。在N-SYN组，手术处理侧纹状体D2R水平仅为 对照侧的26.1±4.7。而N-SYN组手术处理侧纹状体TH表达水平为对照侧的 78.9±3.2。因在纹状体突触前后均存在D2R，而TH仅存在于纹状体突触前，考虑N-SYN 组手术处理侧纹状体中D2R和TH表达下降程度的不一致，总D2R表达水平的下降很可 能是突触前D2R和突触后D2R下降的共同结果。 对双侧纹状体多巴胺和多巴胺代谢产物DOPAC含量采用高效液相色谱合并

12、电化学 检测。N-SYN组手术处理侧纹状体多巴胺和多巴胺代谢产物DOPAC水平为对照侧的 55.9±5.2(p0.01和64.4±3.3(p0.01。N-SYN导致黑质纹状体多巴胺通路严重 损伤，并与DA神经元在中脑黑质致密部的减少程度相吻合。 本研究主要发现和总结 本实验中，我们合成并鉴定了含三个硝化酪氨酸位点，与帕金森病患者脑部病理切 片中所观察到一致的硝化-synuclein蛋白。通过乳酸脱氢酶释放实验和TUNEL实验， 发现在体外和在体实验条件下，硝化-synuclein比未硝化-synuclein对多巴胺神经细 胞具有更大的细胞毒性作用。长期单侧中脑黑质部位注射N

13、-SYN可导致慢性运动缺陷， 出现自主运动减少、运动协调性下降、不对称性增加的症状。N-SYN对多巴胺神经元 所产生的毒性效应和所导致的行为学障碍强烈提示N-SYN可以导致大鼠帕金森样病 变。我们的研究首次提供直接证据证明硝化-synuclein可引起多巴胺神经元死亡。 本研究中，N-SYN作用于大鼠特定脑区，导致多巴胺神经元死亡、大鼠出现帕金 森样行为，为研究帕金森病相关修饰蛋白的生物效应，建立一种更接近病理状态的帕金 森病动物模型提供了一条新途径。 本研究中，硝化-synuclein可不依赖免疫反应引起中脑黑质多巴胺神经元毒性损 伤，引起帕金森病患者类似的行为学表现。本研究为研究特定蛋白翻

14、译后修饰在神经退 行性疾病中的作用开辟了一条新的途径，有望弥补转基因和转染技术无法研究修饰蛋白 的不足。 关键词-synuclein，硝基化修饰，多巴胺能神经元，帕金森病 7.期刊论文 戚辰.刘振国 帕金森病发病机制研究进展:-synuclein与氧化应激 -中国神经科学杂志2004,20(4 帕金森病(PD是一种常见的老年神经变性疾病,它的发病机制与遗传因素和环境因素共同作用有关,但其内在的联系尚不十分清楚.-synuclein可 能起到联系基因和环境因素在PD中的发病机制的作用,而多巴胺导致的氧化应激则可能是神经变性的共同途径.本文就-synuclein和氧化应激在PD发 病机制中作用等方

15、面的研究作一综述. 8.期刊论文 陈涛.唐北沙.廖小平.文国强.严新翔.郭纪锋.张玉虎.曹立.李静.欧阳锋.龙志刚.CHEN Tao.TANG Bei-sha.LIAO Xiao-ping.WEN Guo-qiang.YAN Xin-xiang.GUO Ji-feng.ZHANG Yu-hu.CAO Li.LI Jing.OUYANG Feng.LONG Zhi-gang RNA干扰技术阻断-synuclein基因过表达诱导的-synuclein蛋白病理性积聚的研究 -中 华医学遗传学杂志2008,25(2 目的 构建并筛选针对帕金森病致病基因-synuclein特异、高效的RNA干扰载体,观

16、察应用RNA干扰技术阻断-synuclein过表达导致synuclein蛋白病理性积聚的作用.方法 采用携带H1启动子的PBSHH1质粒,设计并构建针对-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性synuclein基因干扰载体pSYNi-1、pSYNi-2、pSYNi-3、pSYNi-4,通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后,转染HEK293细胞,应用Western印迹、逆转录PER观察干扰载体的有效性,筛选特异、高效的RNA干扰载体.采用脂质2000将筛选的最佳-synuelein-pBSHH1 RNA 干扰载体及野生型-synucleinpEGFP真核细胞表达载体共转染HE

17、K293细胞,并设立对照组,48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染 色观察细胞质内嗜酸性小体的形成.结果 Western印迹、逆转录-PER结果显示,pSYNi-1载体具有高效的RNA干扰抑制作用,效率达69.6%;将synuclein-pBSHH1 RNA干扰载体pSYNi-1及野生型-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞,48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488 nm蓝 色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚,而转染pSYNi-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀;免疫

18、荧光细 胞化学检测结果显示,转染48h后对照组可见-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集,转入RNA干扰载体psYNi-1后胞浆内-synuclein免疫阳性产物分 布均匀;HE结果显示,转染48h后,对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体形成;转入RNA干扰载体pSYNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成 .结论 RNA干扰技术通过抑制-synuclein基因的表达,成功阻断了野生型-synuclein过表达所诱导的-synuelein蛋白病理性积聚,为最终应用 RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据. 9.期刊论文 范国华.刘振国.陈生弟 -synuclein与帕金森病(综述 -中国神经免疫学和神经病学杂