HPLC法测定双黄连颗粒中绿原酸的含量-实验设计

1、仪器分析实验设计方案HPLC法测定双黄连颗粒中绿原酸的含量一、实验目的掌握中药含量测定方法的实验方案设计和测定方法原理及操作。掌握高效液相色谱法的测定原理和高效液相色谱仪的使用。熟悉高效液相色谱法在中药制剂定量分析中的应用。二、实验原理双黄连颗粒收载于2010版中华人民共和国药典（一部）1，由金银花、黄芩、连翘组成，功能疏风解表，清热解毒，用于外感风热所致的感冒。金银花为方中君药，其主要有效成分为绿原酸和异绿原酸。而2010版药典中只收载了黄芩和连翘的含量测定方法，没有金银花的含量测定方法，为了更好的控制双黄连颗粒的质量，提高双黄连颗粒的质量标准，本方案依据绿原酸在25水中溶解度为4%，热水中

2、溶解度更大，易溶于甲醇、乙醇及丙酮,有紫外吸收等特性，本方案拟定采用HPLC法测定双黄连颗粒中金银花的主要成分绿原酸的含量。绿原酸三、 仪器与试药高效液相色谱仪：型号？公司？ ；紫外分光仪：型号？公司？；超声波清洗器：型号？公司？；电子天平: 型号？公司？；绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号：？，含量测定用）；双黄连颗粒由？公司提供（批号：）；甲醇为色谱纯：公司？；水为纯净水（公司）；其它试剂均为分析纯。仪器分析实验设计方案四、实验内容及步骤4.1 缺金银花阴性样品的制备2黄芩50g加水煎煮三次，第一次1h，第二、三次各0.5h，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.051.10

3、（80），于80时加2mol/L盐酸溶液调节PH值至1.02.0，保温1h，静置24h，滤过，沉淀用水洗至PH值5.0，继用70%乙醇洗至PH值为7.0，低温干燥，备用。连翘100g，加水温浸30min，煎煮2次，每次1h，分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.21.25（7080）的清膏，冷至40时，搅拌下加入乙醇，使乙醇量达75%，充分搅拌，静置12h，滤过，合并乙醇液，回收至无醇味，并浓缩成相对密度为1.301.32（6065）的清膏，减压干燥，与上述黄芩提取物粉碎成细粉，加入糊精等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000g，或加入蔗糖，糊精等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥成200

4、g，即得。4.2 对照品溶液的配制3精密称取适量绿原酸对照品，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀，制得约0.1mg/mL的对照品储备液。然后再用该储备液制成对照品溶液。4.3 色谱条件的选择4.3.1 测定波长的选择 取绿原酸对照品储备液稀释至约5ug/ml于200-400nm波长进行紫外扫描，结果在？nm处有最大吸收，结合参考文献故选择？nm作为检测波长。4.3.2 流动相的选择取一批双黄连颗粒样品,研细,取约0.5g,精密称定,置50mL的锥形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,称定重量，超声处理20min。放置至室温,加50%甲醇补足失重,摇匀,滤过,取续滤液过0.45&

5、#181;m微孔滤膜作为供试品溶液4。分别吸取绿原酸对照品溶液和供试品溶液各10ul，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂, 流速为1.0mL/min, 柱温为25。检测波长为 ？nm，以甲醇-水-冰醋酸(15851) 4 乙腈- 0.4%磷酸溶液( 13: 87) 为流动相,为流动相（跟据色谱图微调调节流5仪器分析实验设计方案动相比例）,综合考虑保留时间、分离度、峰形、拖尾因子等优选出适宜的色谱条件。色谱条件定为：色谱柱为？，以？为流动相，流速为？，检测波长为？，进样量为？，柱温25。4.4 供试品溶液制备方法的选择4.4.1提取方法的选择 取一批双黄连颗粒样品,研细,取约0.5g,精密称定,置5

6、0mL的锥形瓶中,加50%甲醇25mL,称定重量，分别超声20min、回流处理60min。放置至室温,加50%甲醇补足失重,摇匀,滤过,取续滤液过0.45µm微孔滤膜。续滤液即为供试品溶液，按上述已定色谱条件测定，结果如下：提取方法 绿原酸含量（%）回流超声4.4.2提取溶剂的选择 取一批双黄连颗粒样品,研细,取约0.5g,精密称定,置50mL的量瓶中,分别加水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇各25mL,称定重量，用项4.1优选出的提取方法提取。放置至室温,用相应溶剂补足失重,摇匀,滤过,取续滤液过0.45µm微孔滤膜即为供试品溶液，按已定的色谱条件进行测定，结果如下：提取溶

7、剂 绿原酸平均含量（%）水50%甲醇甲醇50%乙醇4.4.3提取时间的选择 取一批双黄连颗粒样品,研细,取约0.5g,精密称定,置50mL的量瓶中,加项4.2下优选提取溶剂25mL,称定重量，用项4.1下优选的提取方法处理。放置至室温,加溶剂补足失重,摇匀,滤过,取续滤液过0.45µm微孔滤膜即为供试品溶液，按已定的色谱方法测定，结果如下：提取时间(min) 绿原酸平均含量（%）203060供试品溶液制备方法定为：取一批双黄连颗粒样品,研细,取约0.5g,精密称定,置50mL的锥形瓶,加？25mL,称定重量，？处理。放置至室温,加溶剂补足失重,摇匀,滤过,取续滤液过0.45µ

8、;m微孔滤膜作为供试品溶液。仪器分析实验设计方案4.5 方法学考察4.5.1专属性考察 取阴性对照品按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液，在按照已定色谱条件测定。（在图谱中不应出现绿原酸的峰）4.5.2 线性关系考察 精密称取绿原酸对照品适量,各取？mL注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定。以对照品的进样量µg数为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。槲皮素线性关系考察表绿原酸µg 平均峰面积得线性回归方程？, 相关系数？，结果表明，绿原酸含量在？µg范围内线性良好。线性关系图？4.5.3精密度试验精密吸取绿原酸对照品溶液10µL,注入高效液

9、相色谱仪,连续进样6 次, 测定绿原酸的峰面积，结果如下:序号 A12356ARSD(%)计算RSD值为？%，表明仪器的精密度是否良好。4.5.4稳定性试验 分别于0、2、4、6、8、10h，精密吸取同一供试品溶液10µL,于高效液相色谱仪进样测定一次，测定结果如下：时间(h) 峰面积26810平均峰面积 RSD(%)计算RSD值？%，表明双黄连颗粒样品溶液在？h内稳定。4.5.5重复性试验 精密称取同一批号的双黄连颗粒样品,按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液,按上述色谱方法测定。仪器分析实验设计方案双黄连颗粒W(g)绿原酸平均含量% RSD（%）结果双黄连颗粒中绿原酸平均含

10、量为？，RSD值为？%4.5.6加样回收率试验 分别精密称取已知含量的同一批双黄连颗粒样品9份，加入绿原酸对照品溶液，按供试品液的制备的方法处理，制备所需溶液，按已定的色谱条件测定。绿原酸加样回收率试验结果样品中的含量序号（mg）1 2 3 4 5 6 7 8 9加入量（mg） 测出量（mg） 回收率(%)平均回收率(%)RSD (%)计算回收率，结果样品中绿原酸平均回收率为？ %，RSD为？ %。说明已定的方法具有良好的回收率，可分别用于测定双黄连颗粒中绿原酸的含量。仪器分析实验设计方案参考文献：1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S. 北京：化学工业出版社,2010:？2 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S. 北京:化学工业出版社,2005:4064