第七章生物大分子的色谱分离和纯化ppt课件

1、复复 习习浓差极化浓差极化浓差极化是指在超滤过程中，由于水透浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用层，它对水的透过起着阻碍作用.复复 习习膜的污染膜的污染膜分离过程中随着操作时间的增加，膜膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这

2、降，这被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物水生物(附生附生)污垢所引起的。污垢所引起的。复复 习习防止膜污染的方法防止膜污染的方法（1预处理法预处理法调整供给液的调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化值或添加阻氧化剂来防止化学学劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生生物性劣质等。物性劣质等。 （2开发抗污染的膜开发抗污染的膜（3加大供给液的流速加大供给液的流速 第一节第一节 色谱概论色谱概论一、色谱的概念一、色谱的概念色谱层析是一个建立在吸附、分配、离子交换、色谱层析是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大

3、小等基础上的分离过程。又称色亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色层分离。层分离。二、色谱的特点二、色谱的特点能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。检测出来。它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中其中静止的一相为固定相，相对运动的一相为其中静止的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配系数、离子交换能力、流动相），吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续多次在两相中的质量交换，从而使

4、不同组分得以多次在两相中的质量交换，从而使不同组分得以分离，这就是色谱法所依据的基本原理。分离，这就是色谱法所依据的基本原理。必要条件必要条件充分条件充分条件2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点色谱具有高效、快速和灵敏的特点色谱分离图示色谱分离图示 根据混合物中，溶质在根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进质移动速度的不同而进行分离的方法。行分离的方法。互不相溶的两相分别称互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。为：固定相和流动相。色谱分离图示 三三 、层析的分类、层析的分类 根据溶质分子与固定相相互作用的机理不

5、同的分类根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶过滤法凝胶过滤法分配层析法分配层析法离子交换色层分离法离子交换色层分离法吸附层析法吸附层析法疏水作用色层分离法疏水作用色层分离法金属螯合色层分离法金属螯合色层分离法共价作用色层分离法共价作用色层分离法 根据实验技术的分类根据实验技术的分类低压层析技术低压层析技术中压层析技术中压层析技术高压层析技术高压层析技术电泳法电泳法操作压力在操作压力在0.5MPa-5MPa之间之间操作压力在操作压力在5Mpa-40MPa之间之间操作压力小于操作压力小于0.5MPa靠溶质分子在电场中的移动速度靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离不同而分离 根据固定

6、相的形状不同的分类：根据固定相的形状不同的分类： 柱层析法柱层析法纸层析法纸层析法薄层层析法薄层层析法 根据流动相的物态不同的分类根据流动相的物态不同的分类 汽相层析法汽相层析法液相层析法液相层析法 操作方式不同的分类操作方式不同的分类迎头法迎头法顶替法顶替法洗脱分析法洗脱分析法层析分类 分类原则分类原则类型类型特征特征据溶质分子与固定据溶质分子与固定相相互作用的机理相相互作用的机理不同不同吸附色谱吸附色谱离子交换色谱离子交换色谱疏水作用层疏水作用层金属螯合色谱金属螯合色谱共价作用色谱共价作用色谱分配色谱分配色谱凝胶过滤凝胶过滤亲和色谱亲和色谱吸附力不同吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能

7、力的不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同据实验技术据实验技术 低压色谱低压色谱中压色谱中压色谱高压色谱高压色谱电泳电泳操作压力小于操作压力小于0.

8、5 MPa0.5 MPa操作压力在操作压力在0.50.55 MPa5 MPa之间之间操作压力在操作压力在5 540 MPa40 MPa之间之间溶质分子在电场中的移动速度不同溶质分子在电场中的移动速度不同据固定相的形状不据固定相的形状不同同柱色谱柱色谱纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不据流动相的物态不同同 气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱超临界流体色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为气体流动相为

9、液态流动相为液态流动相为液态流动相为液态按操作方式不同按操作方式不同 迎头法迎头法顶替法顶替法洗脱法洗脱法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将混合液尽量浓缩，

10、使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。吸附色谱与其它色谱法的异同点 类型类型机理机理优点优点缺点缺点适用范围适用范围吸附色谱吸附色谱化学、物理吸附化学、物理吸附操作简便操作简便易受离子干易受离子干扰扰各种生物大分各种生物大分子的分离、脱子的分离、脱色、和去热源色、和去热源凝胶过滤凝胶过滤分子筛的排阻效应分子筛的排阻效应分辨力高，不分辨力高，不会引起变性会引起变性各种凝胶介各种凝胶介质昂贵，处质昂贵，处理量有限制理

11、量有限制分子量有明显分子量有明显差别的可溶性差别的可溶性生物大分子生物大分子分配色谱分配色谱溶质在固定相和流溶质在固定相和流动相中分配系数的动相中分配系数的差异差异分辨力高，重分辨力高，重复性较好，能复性较好，能分离微量物质分离微量物质影响因子多，影响因子多，上样量太小上样量太小用于各种生物用于各种生物大分子的分析大分子的分析鉴定鉴定亲和色谱亲和色谱亲和色谱生物大分亲和色谱生物大分子与配体之间有特子与配体之间有特殊亲和力殊亲和力分辨力很高分辨力很高 一种配体只一种配体只能用于一种能用于一种生物大分子，生物大分子，局限性大局限性大各种生物大分各种生物大分子子聚焦色谱聚焦色谱等电点和离子交换等电点

12、和离子交换作用作用分辨力高分辨力高进口试制昂进口试制昂贵贵蛋白质和酶蛋白质和酶三、色谱的分类三、色谱的分类两两 相相 物物 理理 状状 态态作作 用用 机机 理理固定相的物理特性固定相的物理特性流动流动相相固定相固定相名名 称称原原 理理名名 称称物理特性物理特性名名 称称液相液相气体气体液相液相固相固相液体液体固体固体液相色谱液相色谱液液色谱液液色谱液固色谱液固色谱气相色谱气相色谱气液色谱气液色谱气固色谱气固色谱分配系数分配系数吸附能力吸附能力分子大小分子大小离子交换离子交换能力能力亲和力亲和力分配系数分配系数吸附能力吸附能力液液分配色谱液液分配色谱液固吸附色谱液固吸附色谱凝胶渗透色谱凝胶渗

13、透色谱离子交换色谱离子交换色谱亲和力色谱亲和力色谱气液分配色谱气液分配色谱气体吸附色谱气体吸附色谱 板状板状 纸纸 一薄层一薄层 根柱子根柱子填充紧密填充紧密空心管壁空心管壁流动相高流动相高压压 根柱子根柱子填充紧密填充紧密空心管壁空心管壁平板色谱平板色谱 纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱柱色谱柱色谱(液相液相)填充柱色谱填充柱色谱空心柱色谱空心柱色谱高效液相色谱高效液相色谱柱色谱柱色谱(气相气相)填充柱色谱填充柱色谱空心柱色谱空心柱色谱1.5 层析剂种类层析剂种类氧化铝氧化铝硅胶硅胶活性炭活性炭琼脂糖琼脂糖 纤维素纤维素 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物现代色谱技术中除了分配色谱、吸

14、附色谱外，生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则：和色谱等。选择的原则：易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交换色谱；换色谱；样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。中进行，因此柱色谱的应用非常广泛

15、。 Principles of Operation for Chromatography TechniquesIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase1.色谱分离种类色谱分离种类国产气相色谱仪HP高压液相色谱仪美国气相色谱仪4.分离设备分离设备4.分离设备分离设备4.分离设备分离设备制备色谱技术制备色谱技术生产规模制备生产规模制备色谱柱直径色谱柱直径100-800mm中试规模制备中试规模制备色谱柱直径色谱柱直径50-150mm小量制备，小量制备，色谱柱直径色谱柱直径10-40mm4.分离设备分离设备制备液相色谱系列半制备

16、液相色谱半制备液相色谱中试规模制备色谱中试规模制备色谱工业规模制备色谱工业规模制备色谱制备液相色谱制备液相色谱分析液相色谱分析液相色谱 不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和检测器检测器4大部分。大部分。1.柱色谱系统的组成柱色谱系统的组成 色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、

17、检测器、记录仪以及似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。部分收集器等几个部分构成。 柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成： A A 蠕动泵蠕动泵 B B 层析柱层析柱 C C 装柱装柱 D D 加试样加试样 E E 洗脱洗脱 F F 检测器检测器 G G 部分收集器部分收集器柱层析系统的组成柱层析系统的组成柱层析装置图柱层析装置图 缓缓冲冲液液管管柱柱梯梯度度制制造造器器监监视视器器记录器记录器分分划划收收集集器器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoir胶胶体体装装填填胶胶体体A2

18、 2 纸层析法纸层析法2.1 2.1 基本原理基本原理2.2 2.2 操作方法操作方法2.3 2.3 操作步骤操作步骤小实验小实验1234这就是纸层析法。这就是纸层析法。对照上图，可知道对照上图，可知道1-4号的各代表什号的各代表什么氨基酸。么氨基酸。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。酸组成的重要工具。 1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示纸层析小实验动画演示凝胶装置图色谱峰和分离结果 1层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。 2层析材料的准备 许多材料都可在层析

19、法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。 3装柱 层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至13体积，并使支持板下的“死体积不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层。最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂

20、彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。 4上样上样 样品浓度越高越好；上样体积越小，分样品浓度越高越好；上样体积越小，分辨率越高；辨率越高； 上样体积一般为床体积的上样体积一般为床体积的15%； 例外：例外：G-25脱盐脱盐30% 亲和层析亲和层析为床体积的几倍为床体积的几倍 5洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。3洗脱 影响分离效果的主要因素之一： 洗脱流速。 要求流速合适而恒定。 洗脱方式洗脱方式 连续洗脱连续洗脱continual elution）：同一种洗脱液洗脱）：同一种洗脱液洗脱 分步洗脱分步洗脱stepwi

21、se elution）：用两种或两种以上）：用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱不同洗脱液分段洗脱 梯度洗脱梯度洗脱gradient elution）：梯度改变洗脱液的）：梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性值、离子强度或极性 梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形成装置阀或简易梯度形成装置 梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、凸指数梯度以及复合梯度度、凸指数梯度以及复合梯度 浓度梯度制造器浓度梯度制造器 6.部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。

22、这种装置能使每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或260 nm的光吸收来进行连续监测。 6 洗脱液的分部收集洗脱液的分部收集 收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱完毕为止。完毕为止。 收集的体积或时间）：随样品的性质、填料、柱子的收集的体积或时间）：随样品的性质、填料、柱子的直径和流动相而变化。一般每管收集的体积直径和流动

23、相而变化。一般每管收集的体积 为为35mL实实验室）。验室）。 收集的总体积：离子交换层析为床体积的收集的总体积：离子交换层析为床体积的3倍；倍； 凝胶层析为凝胶层析为1个床体积个床体积 6洗脱液的检测和合并洗脱液的检测和合并 分部收集的试管内的化合物需要进行定性或分部收集的试管内的化合物需要进行定性或/和定量鉴定。和定量鉴定。 鉴定的方法根据目的物的性质而确定。鉴定的方法根据目的物的性质而确定。 小分子化合物：脂类、糖类和氨基酸小分子化合物：脂类、糖类和氨基酸薄层层析或纸层析薄层层析或纸层析显色反应。显色反应。 大分子化合物：蛋白质和核酸大分子化合物：蛋白质和核酸分光光度法测定光吸收值。分光

24、光度法测定光吸收值。 蛋白质：蛋白质：280nm；DNA和和RNA：254nm。 洗脱液可通过紫外检测器进行连续监测，并将结果由记录洗脱液可通过紫外检测器进行连续监测，并将结果由记录仪描绘出来；根据吸收曲线收集、合并相关试管的洗脱液，以仪描绘出来；根据吸收曲线收集、合并相关试管的洗脱液，以进一步处理。进一步处理。 用色谱法来解决预分用色谱法来解决预分离和复姓便成为色谱离和复姓便成为色谱工作者当今快速分离工作者当今快速分离和纯化及降低治疗蛋和纯化及降低治疗蛋白或诊断蛋白的一个白或诊断蛋白的一个热门研究课题。热门研究课题。 首先选择色谱柱类型首先选择色谱柱类型 然后选择色谱柱的填料颗粒和尺寸）然后

25、选择色谱柱的填料颗粒和尺寸） 接着确定柱尺寸的大小接着确定柱尺寸的大小 接着选择流动相组成、流速和洗脱方式）接着选择流动相组成、流速和洗脱方式） 最后一旦选定了几种不同色谱的最优化条最后一旦选定了几种不同色谱的最优化条件，接着便是如何将这些单元进行组合以件，接着便是如何将这些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺了。得到最佳分离和纯化工艺了。 最优化要以产品质量和经济效益为目的。最优化要以产品质量和经济效益为目的。线性放大线性放大固定以下条件1. 相同线行流速2. 相同缓冲液3. 相同填料4. 相同柱高5. 相同样品浓度和pH6. 相同样品体积和柱床体积比例7. 相同梯度体积和柱床体积比例放大1

26、. 柱直径2. 体积流速3. 上样体积 原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。 对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，孔径在25100um 避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离物质的生物活性。 具有“一石四鸟的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达产物时具有除去变性剂盐酸胍）、使蛋白质折叠复性）、去除杂蛋白、便于变性剂回收。二、各种复性方法的比较二、各种复性方法的比较SECIECAFC中压中压或常或常压色压色谱谱HIC高压高压色谱色谱慢慢 快快负荷

27、受限、分离效果差；负荷受限、分离效果差；负荷高，分离效果好，盐负荷高，分离效果好，盐酸胍使用受限；酸胍使用受限；使用范围窄，成本高，手使用范围窄，成本高，手续繁杂，时间长续繁杂，时间长质量和活性回收率大于质量和活性回收率大于90%，较理想的复性纯化，较理想的复性纯化手段。手段。RPLC是利用溶质分子中非极性是利用溶质分子中非极性集团与非极性固定相间相互作用集团与非极性固定相间相互作用力大小与溶质分子极性集团与流力大小与溶质分子极性集团与流动相中极性分子在相反方向上相动相中极性分子在相反方向上相互作用力大小的差异进行分离的。互作用力大小的差异进行分离的。非线性色谱的相关知识非线性色谱的相关知识色

28、谱法的基本特点：色谱法的基本特点：1.分离效率高分离效率高2.应用范围广应用范围广3.操作参数多操作参数多4.高灵敏度在线检测高灵敏度在线检测5.快速分离快速分离6.连续自动化操作连续自动化操作非线性色谱的相关知识非线性色谱的相关知识色谱的发展从分析规模转向了制备规模，色谱的发展从分析规模转向了制备规模，致使色谱学在理论上从线性色谱发展到非致使色谱学在理论上从线性色谱发展到非线性色谱。线性色谱。非线性色谱的相关知识非线性色谱的相关知识线性色谱：流动相中样品的浓度线性色谱：流动相中样品的浓度Cm与固定与固定相中样品的浓度相中样品的浓度Cs之间呈线性关系。之间呈线性关系。非线性色谱：流动相中样品的浓度非线性色谱：流动相中样品的浓度Cm与固与固定相中样品的浓度定相中样品的浓度Cs之间不呈线性关系。之间不呈线性关系。非线性色谱的相关知识非线性色谱的相关知识一：线性色谱与非线性色谱根本区别一：线性色谱与非线性色谱根本区别1.样品的保留值可变样品的保留值可变保留时间保留时间5.230）：尿苷）：尿苷保留时间保留时间6.962）：鸟苷）：鸟苷保留时间保留时间8.443）：腺苷）：腺苷保留时间保留时间11.132）：肌苷）：肌苷保留时间保留时间12.848）：虫草素）：虫草素 蛹虫草子实体中虫草素、腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷的HPLC图谱 非线性色谱的相关知识非线性色谱的相关知识一：线性色