单细胞凝胶电泳对人类肝癌细胞的研究

1、通过单细胞电泳观察受重离子辐射的人体肝癌细胞的DNA损伤摘要目的：现在很多国家都已经发展了癌症的重离子疗法，特别是在GSI(Gesellschaft fur Schwerionenforschung mbH，Darmstadt，Germany已经取得了引人注目的成果，但是由于重离子运行方式的复杂性阻碍了实际运用，因此基础理论仍然需要更深的研究。在这篇文章中，我们将使用单细胞凝胶电泳来测量重离子辐射对于SMMC-7721细胞的基因毒性。X射线、射线、紫外线以及快中子辐射造成的DNA损伤资料已经相当完备，但是迄今为止关于重离子在这方面影响的研究很少。据此，我们尝试通过彗星实验来检测重离子辐射对肝癌

2、细胞的影响，同时建立一个临床可用的重离子癌症疗法的数据库。方法：本次实验所选用的材料是人体肝癌细胞，在中国兰州重离子加速器接受80MEV/U的辐射，剂量分别为0,0.5，1,2,4,8Gy，然后立即使用凝胶电泳检测DNA损伤，每个剂量的样品选取100-150个细胞，记下慧尾的长度和数量，并用EXCLE分析数据。结果：在受到0.5Gy到8Gy的辐射处理后，我们从彗星实验图像发现SMMC-7721细胞都受到损坏。慧尾的长度和尾距都随着剂量的增加而增加，而出现慧尾的细胞的数量也随着剂量的增加而增多。当剂量达到2Gy时，接近100%的细胞都受到损伤。此外，慧尾的长度和距离都显示出了线性关系。结论：通过

3、清晰的彗星实验图像，我们的实验证明彗星实验可以用来测量重离子对DNA的损伤。同时DNA损伤和重离子的剂量有明显的对应关系，而且SMMC-7721细胞对有很大的辐射敏感度。剂量改变而引起DNA的不同的反应可以佐证彗星实验对重离子诱变引起的DNA损伤检测也是有效的。引言在过去的几十年里，从基础的物理、化学到生物肿瘤和实验室放射疗法开始逐步发展，辐射研究已经成为一个专门的分支学科。虽然关于X射线和射线的放射生物学影响已经有了广泛的研究，但是关于重离子束的放射生物学影响的研究却少之又少。随着人类足迹向外太空的迈进，关于高线性能量转移的研究吸引了越来越多的目光。随着二十世纪七十年代中期LBL首次运用重离

4、子来治疗癌症，美国已经得出了比传统的软组织瘤、骨癌、前列腺癌的放射疗法更加有前途的结果。现在许多国家的科学家都已经设计出加速器来产生重离子束并用于临床治疗，并且已经开始进行一些重离子癌症疗法的初步研究，比如，碳、氖、氧和氩。本研究的目的是为了通过彗星实验研究重离子对DNA损伤的诱导作用，其理论值将会同X射线、射线以及其他辐射所造成外部影响比较，并据此建立一个可供临床使用的疗法数据库。碱性状态下的彗星实验由于其简单性和准确性已经成为一种分析由化学和物理因素引起的DNA损伤的主流方法。DNA损伤包括DNA链的断裂，碱不稳定位点，修复中心的不完全剪切。虽然直接的DNA损伤程度可以碱性洗脱、切口平移、

5、碱基单细胞凝胶电泳来加以估测，但是单细胞凝胶电泳比前两者表现出更好的敏感性。单细胞凝胶电泳已经被证明在敏感性方面比微核的胞质分裂阻断检测有令人瞩目的优势。更重要的一点是单细胞凝胶电泳是一种电泳技术，可以进行单个细胞的DNA损伤和DNA修复率的检测。因此受重离子辐射的细胞所产生的DNA的急性损伤和慢性损伤可以反映成为最初损伤或者残留损伤，前提是如果时间允许酶去修复DNA的断链。在我们实验室，我们的主要研究方向就是探究重离子对肿瘤细胞的放射生物学影响。以前的实验我们主要进行的是细胞存活测量但是不能在分子水平上解释敏化辐射的潜在机理。为了检测受重离子辐射的细胞DNA的放射生物学影响，单细胞凝胶电泳，

6、也称为彗星实验被用来直接测量细胞的DNA损伤。实验材料和方法细胞和细胞培养人类肝癌细胞株SMMC-7721购买自上海第二军医大学，我们用添加了15%小牛血清的RMIP-1640培养基在标准恒温箱中于37下培养。每天换液1次，每23天消化传代1次，这么做是为了保证细胞在良好的条件下生长。在接受辐射的前两天，细胞会被转移到35mm的培养皿中，每个培养皿含有2ml的细胞悬液，细胞的密度是每毫升50000个，每一个剂量有五个平行样。在接受辐射之前，每个培养皿中的细胞都会在倒置的光学显微镜下接受检查来选择生长状况和密度都良好的材料，此时RMIP-1640 Medium培养基将会被去除，只有Dulbecc

7、o氏磷酸盐缓冲培养基来维持细胞在接受辐射前的湿度。离子束的选择我们选用的是离子束，能量为80兆伏，电流强度为0.00136纳安。细胞受到的辐射的吸收剂量分别为0.5、1、2、4、8Gy。细胞受到的辐射剂量由气体电离箱测量。单细胞悬液的制备和彗星实验辐射结束之后，洗涤和收集细胞，在单细胞悬液中添加Dulbeeco氏磷酸盐缓冲液后，最终的细胞浓度（5-10）×。碱性状态下的彗星实验是在奥斯汀和约翰逊的基础上略作修改发展而来的，在进行电泳实验时，取10l新鲜的细胞悬液于Dulbecc氏磷酸盐缓冲液中（Ph为7.4），然后与30l0.5%低熔点琼脂混合，混合后平铺于覆盖有0.5%正常熔点琼脂

8、的载玻片上，然后再盖上盖玻片（目的是在室温下干燥来防止灰尘和其他粒子的干扰）。待低熔点琼脂在冰箱中凝固十分钟之后，小心的取下盖玻片并将载玻片慢慢的浸入到刚制备好的细胞裂解液中。从操作开始到电泳的结束，所有的步骤都要避免阳光的照射。裂解1-1.5个小时之后，将载玻片放置到电泳仪中，6个样品的18个载玻片随机放置在电泳槽中。在电泳缓冲液中进行20-30分钟的DNA解旋之后，然后在另一组缓冲液中进行单细胞凝胶电泳。在电泳结束后，使用0.4mol的磷酸酯进行中和化（pH=7.5）。DNA损伤评估用溴化乙锭的水溶液对载玻片染色后，盖上盖玻片，使用放大倍速为10×20倍的荧光显微镜观察。同一个剂

9、量的样品数量为100-150个细胞。记下慧尾的长度以及含有慧尾的细胞的数量，与此同时，用135号黑白底片照相。最后，使用EXCEL对数据加以分析。结果和讨论彗星实验中慧尾的形成机理彗星实验之所以被大量采用有很多原因，除了其测量的迅速、简便、灵敏、可靠以及相对的廉价之外，彗星实验可以提供非常有价值的图像。图1 不同处理剂量下的彗星实验图像关于慧尾的构成有两个解释。其一是DNA碎片；其二是DNA碎片的长度大约为1mm，而慧尾的长度只是碎片的几个百分点。就本实验而论我们得到的慧尾的平均长度不超过200m。细胞核中的DNA不是混乱无序的链状结构，就像单细胞凝胶电泳操作一样，即使是在洗涤或者高浓度的盐溶

10、液处理后，细胞核仍保持一定的结构，DNA的组织结构是螺旋状的，然后在形成超螺旋被包裹在细胞核中。库克等人推断出超螺旋的封闭结构，后来他们观测到这一现象，当DNA受到辐射时，DNA超螺旋解开，环状封闭结构变成一个围绕拟核的圈。以此类推，人们推测慧尾是由解开的DNA螺旋构成的，慧尾上的环结则表明了DNA断链的数目。碱性彗星实验可以观测到单链或者双链DNA的断裂，AP位点的产生，这是由于碱基不稳定性或者在凝胶电泳实验的高PH造成的DNA断链。本次的彗星实验实质上是包含了凝胶电泳之前和过程中的高pH潜伏期，而和贾斯汀和约翰逊最开始试验中所用的中性pH。柯林斯证明中性和碱性方法都可以检测到微小的DNA损

11、伤，但是高度的DNA损伤在碱性条件下往往检测的更加清楚，因此在我们的实验中选用的是碱性彗星实验。此外，DNA断裂可能会由于细胞通过碱基切除和核苷酸切除引起细胞修复而短暂出现，因此彗星实验中出现的高度的损伤可能表明严重的损伤或者有效的修复。事实上，我们可以通过开发细胞修复来产生DNA损伤从而获得或者放大由放射带来的影响，而这些信息可能无法通过彗星实验来获得有效的结果。关于重离子的修复效应我们将在今后的工作中讨论。重离子造成的DNA损伤单细胞凝胶电泳或彗星实验是对分裂间期细胞DNA损伤的一种直观的视觉展现的方法。这项技术对于检测单个细胞的DNA单链断裂和碱基对损伤以及剪切修复都特别的灵敏。彗星实验

12、广泛用于如下几个领域：放射生物学、剪切引起的DNA损伤、DNA交联、氧化损伤、基因毒理学和细胞凋亡。电离辐射在环境介质中式普遍存在的。它的生化作用可以对细胞DNA造成影响，产生一系列的基本的损伤：比如单链断裂、双链断裂、DNA和DNA交联或DNA和蛋白质交联，嘌呤和嘧啶成分的损伤。使用电离辐射可以避免因药物新陈代谢、细胞内分配、细胞膜渗透、药物分解而产生的副作用。虽然单细胞凝胶电泳技术对电离辐射非常灵敏，由X射线、射线、紫外线、快中子辐射所造成的损伤数据已经相当多，但是目前为止关于重离子的研究却相当少。微量测定应当注意：对于某一个给定类型的放射物，其造成的DNA损伤必须和投加剂量成比例，因此除

13、了由剪切修复改变造成的影响之外，剂量的投加大小可能不会是和结果有关的决定性因素。利亚很早就提出，重离子是一类高度线性能量转移的辐射。我们预期的是重离子很可能会对细胞DNA造成很大的影响，但是我们却无法确定在受到重离子辐射后这种影响是否可以用一个线性方程表示出来。本实验中，由剂量从0-8Gy不等的重离子诱变产生的DNA损伤数据如下表所示。关于慧尾长度和尾距的剂量相应曲线在图二中给出。我们可以看到慧尾长度和慧尾曲距都有线性关系。这证明SMMC-7721细胞对重离子有很强的辐射敏感度而且彗星实验对检测重离子诱变产生的DNA损伤非常有效。表1 通过彗星实验检测经过80MEV/U的辐射之后的DNA损伤图

14、三表示随着剂量的增加DNA慧尾会改变。我们发现当吸收剂量达到2Gy时，几乎100%的细胞的DNA都受到损伤。但是关于当剂量高于2Gy时细胞DNA具体受到多大损伤的细节还不得而知。为了完全评估有不同剂量造成的DNA损伤，每种剂量的图像被分类成为0-4个等级以度量损伤的严重与否。图四的结果表明，随着剂量的增加，轻微损伤的DNA开始转变成为更加严重的DNA损伤。图二 慧尾长度和尾距曲线图三 处理剂量和DNA慧尾的响应曲线我们应该更加注意2Gy这个剂量，这是传统的射线疗法所选择的剂量。在2Gy这个剂量上，100%的细胞都受到损伤，DNA也受到四个不同程度的损伤。在它们之中25%的细胞受到严重的损伤。众所周知，放射生物学的主要研究对象就是