通过胶原管架桥使轴突从脊髓到神经根再生长的研究

1、通过胶原管架桥使轴突从脊髓到神经根再生长的研究【摘要】目的探讨用胶 原管(collagen tube)架桥于脊髓前角与撕脱的脊神经根间，促使轴突再生长， 以修复脊髓到周围神经的传导通道。方法用大白鼠制成臂丛损伤模型，分为四组。A组用胶原管架桥连 接脊髓前角与撕脱的神经根；B组把自体坐骨神经分支移植物放入到连接于脊髓前角与神经 根的胶原管内；C组用一段周围神经移植物架桥在脊髓与撕脱的神经根之间；D组为仅作神经 根撕脱的对照。结果采用电生理学监测修复后肌肉的电生理活动及收缩功能，通 过病理学及组化学，观察脊髓和神经元的轴突再生状况并作了移植物的形态学分析，证明大 量的新生神经纤维经过移植物进入到被

2、修复的神经根及其周围神经，并使神经组织和肌肉重 新形成了运动终板，从而恢复了一定的肌肉收缩功能。结论用胶原管架桥作CNS到PNS神经再连接，是在神经移植实验 中可促使轴突再生长的有效方法。【关键词】臂丛损伤胶原管内修复脊髓电生理学病理学 Axonal regrowth through collagen guidance channel from spinal cord to nerve roots:experimental study in adult ratsLIU Song, LIU Zongh ui, G.Said, et al.(Dept. of Neurosurgery, Navy

3、General Hospital, Beijing 100037)【Abstract】ObjectiveTo investigate axo nal regrowth from cervical spinal cord to avulsed nerve roots through an implant ed c ollagen guidance channel in adult rats after brachial plexus injuries.MethodsFifty four adult SD rats underwent avulsion of th e right C5-7 ner

4、ve roots. Group A(n15):a collagen guidance channel was used t o bridge the cervical spinal cord and the disconnected C6 nerve root. Group B(n 15):after the same repair procedure as in group A, a segment nerve autograft w as freely introduced into the collagen channel. Group C(n15):a nerve autograf t

5、 was used to bridge the cord and the root. Group D(n9):no repair was performe d after avulsion of the nerve roots.ResultsNine months surgery, electrophysiology and histol ogy showed that neuroanatomic and functional connection were restablished betwe en the cervical spinal cord and the denervated ta

6、rget biceps through the repaire d root pathway in all treated animals. After analyzing the data obtained, no sig n ificant difference was found between the treated groups (Group A,B and C).No evi dent regeneration and no functional recovery was detected in the control group D .ConclusionThe collagen

7、 guidance channel can be used to reconnect the spinal cord and the disconnected nerve root after brachial plexus injury in adult rats. At least when short gaps are required, this kind of chann el appears to act as effectively as a nerve autograft for promoting axonal regro wth.【Key words】Brachial pl

8、exusEntubulation repairSpinal cordElectrophysiologyPathology为了探讨脊髓损伤后神经传导再通的可能性，我们采用胶原管(IV/IVOX)架 桥于脊神经与脊髓前角间，研究轴突再生及其失神经支配肌肉功能恢复的可能性，取得良好 疗效，现报告如下。资料与方法1，Laquerriere等2报告方法 相同。制成双壁胶原管，外层由型胶原的混合物和氧化过的型胶原蛋白构成，比例为4 1，内层由型胶原蛋白制成。神经引导管长10mm，内径1.5mm，用Gamma射线(25GY)消毒 。3.手术方法：全麻下制成鼠臂丛神经损伤模型，在手术显微镜下先作鼠的C46颈椎

9、板切除 ，用控制牵引法把右C57神经根撕脱出，对C5和C7神经根行切断和结扎。修补方法分成四 组：A组(15只)：使用胶原管修补C6神经根。把胶原管一端置入C56根间脊髓腹侧前角区 内2.0mm，在硬膜上用10/0丝线固定，然后把神经根从另端引入胶原管内并用10/0丝线固 定，使神经根与脊髓间有3mm间隙(测量用occular micrometer)。常规关闭肌肉与皮肤，术 后肌注青霉素预防感染，动物送术后恢复室。B组(15只)：方法与A组手术相同，但取一段 自体右坐骨神经置入胶原管，使其与脊髓前角及神经根接触。C组(15只)：用一段移植的5 mm自体神经段修补C6神经根，即：用长的右坐骨神经

10、分支作脊髓与神经根间搭桥，另端置入 脊髓前角内2.0mm，一端与神经根连接，用10/0缝合固定三针。D组：对照组(9只)只作神 经根撕脱不作修补。4.电生理学检查：术后9个月，全麻行肌电(EMG)、运动皮层诱发电位(MEP)、肌肉运动电 位 (MAP)和靶肌肉收缩力的电生理学测定，以评价神经肌肉功能恢复的情况。(1)EMG：将双极 针式电极插入肱二头肌内，用RACIA21P(RACIA， Le Bouscat, France)监视器放大并记录肌 肉在静止状态下电位活动。正常情况下有神经支配的肌肉呈现电静寂状态，而去神经支配的 肌肉则呈现自发的、重复的肌纤颤电位活动3，4。(2)MEP：颅骨钻孔

11、显露两侧皮 层运动区，单极刺激电极经钻孔与所测肌肉对侧的皮层运动区接触，对照电极置于上腭与舌 之间。双极记录电极插入到所测的肱二头肌内，另一单极电极插入皮下并与地线相连。用RA CIA21P行皮层电刺激，刺激脉宽为0.05ms，强度为4.3mA。记录综合200个电刺激所诱发的 MEP平均值。(3)MAP：重新显露脊髓及修复神经根间的移植物，将刺激电极与移植 物相 接触，记录电极插入到肱二头肌内，用RACIA21P行脉宽为0.1ms，强度为0.1mA的电刺激及 记录肱二头肌的电位活动情况12。一次刺激取一次记录，MAP振幅的测量同MEP。 (4)靶肌肉收缩力的测定：暴露肱二头肌，将其远端肌腱切断

12、并固定于等张力换能器上(goul d electronique, France)。在电刺激肌皮神经的同时，用四管示波器(windograph TM, gou ld electronique)记录肌肉的强直收缩力。换能器校正用标准的200g法码。5.辣根过氧化酶(HRP)对中枢神经元的逆行性标记：在电生理学检查前48小时给鼠再麻醉后 打 开原手术部位，将右颈4和颈8神经根切断，以防HRP通过这些根弥散。用20130%HRP溶液在 肱二头肌上作多个点注射，48小时后行动物心脏内灌注磷酸缓冲盐液(PBS)0.1M，内含肝素 10U/ml，随后用0.1M缓冲液(PB)配成的3.6%戊二醛液灌注将动物杀

13、死固定。取C38脊 髓 段置于3.6%戊二醛液内固定3小时再移入30%糖液内72小时。每组脊髓标本纵切或横切成30 m厚切片，固定于载物片上，HRP用四甲基联苯胺和过氧化氢复染13。切片用中 性红复染、脱水和覆盖后行光镜检查，以记录HRP染色的神经细胞数及其所分布的区域。6.移植物的组织化学分析：将移植物及远端所连的神经从脊髓上切除置于karnovsky液固定3 小时，然后用四氧化铁液固定和用epon包埋后行半薄(1m)及超薄(0.3m)横断组织切片 ，半薄切片用硫堇半染色作光镜检查。超薄切片用乙酸双氧铀和枸橼酸染色后作电镜检验。 7.靶肌肉的组织化学分析：在动物灌注前，取双侧的肱二头肌放入到

14、4% paraformaldehyde 液 中固定72小时，然后放到30%的糖液中。用冰冻切片机行30m纵行组织切片。按照Karnovsk y和Roots方法5结果1.动物行为：所有移植的动物在生存期(除右前肢麻痹外)均无任何神经学的缺失 。尸解：所有胶原管和移植神经都适当的置入脊髓内，移植物与神经根间没有破裂，可看到 残留的胶原管及其周围形成的新血管网，未见神经根及其周围神经的萎缩现象。在D组动物 则表现有显著的肱二头肌和肌皮神经萎缩。(1)EMG记录显示所有的神经根被修复(A，B，C组)，肱二头肌肌肉电位表现为正常的静止状 态，说明肌肉失神经后神经再支配。相反在对照组(D组)观察到有典型的

15、自发性肱二头肌 去神经电位反应。(2)MEP从200个电位的平均值，得出振幅为：A组(6.0047.00V)平均17.5112.03 V；B 组：(5.1973.50V)平均27.8322.62V；C组：(6.2547.00V)平均27.34 15.82V。在A，B和C组间 无统计学的显著差异，(F0.95)。对照组(D组)MEP的 平 均总振幅是0.430.96V(02.156mv)，比其它组所见明显小(Avs, D, F6.34；Bvs , D, F6.80；Cvs, D, F16.49；P0.05)。(3)MAP：当电刺激植入的移植物(胶原管或移植神经)时，所有修复神经根的肱二头肌均出现

16、 MAP。平均振幅为：A组：64567V(563727V)；B组：1161378V(8131687V)； C组：1015150V(8131171V)。三组间不存在统计学显著差异。D组未测到MAP。2.肌肉收缩力的测定：修复肱二头肌收缩力的平均值为：A组：5233g；B组：7485g；C 组：7341g。三组间不存在显著差异(F0.41，n.s)。对照组D组未见患侧肱二头肌 收缩反应。3.在CNS神经元用辣根过氧化酶(HRP)逆行性标记显示：再生的轴 突通过置入的移植物及其远端被修复的神经根与肱二头肌发生再连接。所有接受神经根修补 的动物均被HRP标记神经元，这些细胞位于脊髓前角移植物的附近。H

17、RP所逆行标记的平均细 胞 数为：A组58.5537.89个细胞(排列由14132)；B组为78.3862.11个细胞(从1921 1)；C组97.2556.23个细胞(从32191)。经统计学分析，各组间没有显著差别(Avs.B, F0.66；Avs.C, F2.87；Bvs.C, F0.36；n.s.;P0.05)。在D 组(对照组)HRP阳性脊髓细胞数在5以下。4.移植物的形态学分析：移植物及其远端的被修复的神经根、周围神经的横切半薄切片进行 光学显微镜检查，所有修复组显示有大量的有髓高致密新生神经纤维束。A、B组在胶原管内 壁和外壁存在有新生血管网。有些再生的神经纤维被发现在胶原管外侧

18、壁。用电镜检查了0.3m的超薄切片，证实大量的有髓新生神经纤维，在切片上偶也可看到一 些无髓纤维。5.靶肌肉的组织化学分析：光镜下可见成堆的新生运动终板出现在修复侧的肱二头肌内。这 些新生的运动终板体积较小呈无规律状分布，明显不同于对侧正常的肱二头肌内呈线性有规 律分布的正常运动终板。D组未见这种呈现运动终板的组化反应。讨论虽然Carlsted, Hoffmann等6-8报道了可以通过把撕 脱的神经根再植入到其本身的脊髓段内，从而达周围所丢失功能的恢复，但对严重的 挫裂伤或神经根缺损大的损伤，这种修补手术是很难完成的。参考Bertelli and Mira 9所报道的用周围神经移植物来连接脊髓

19、及撕脱的神经根，我们提出了用胶原管架桥 代 替神经移植物来促进脊髓轴突再生，从而建立脊髓与撕脱的神经根间的传导通路10， 11。这种方法可能避免因移植神经所带来的一些不良后果，如移植神经源及移植后所造 成其本身支配区的功能缺损。术后电生理学及组 织学检测证明脊髓的轴突顺利地通过胶原管进入到神经根并到达远端瘫痪的肌肉，形成新的 运动终板，使肌肉恢复了收缩功能。Cadelli等4研究发现在CNS中少突胶质细胞与星形细胞有明显抑制轴突生长的作 用，周围移植物神经在中枢或周围神经系统损伤的修复实验中是能促进轴突再生的最好物质 12，13。研究证明，由于周围神经中富含的雪旺氏细胞及其在退变过程中的增 殖

20、反应，构成了中枢神经系统所缺乏的神经营养因子源和支持轴突再生的基质骨架结构，提 供了使轴突再生的良好环境14，15。在广泛应用周围神经元移植物促进中枢神经 再生长的实验中，已证明植入是必要的条件，并发现主要是植入点与周围神经移植物相近的 受损神经元发生再生长并长入到移植物中12，14。考虑到中枢胶质细胞所产生的 抑制神经纤维再生的作用主要位于脊髓白质内，我们把胶原管直接植入到脊髓灰质内接近其 前角，则可大大减少这些抑制作用10。尽管在仅用胶原管修复的动物中，脊髓到 神经根有一间隙，但由于胶原管本身的硬度和韧性，可以长时间的维持脊髓前角到神经根的 直接通道，从而使远端神经根释放神经营养因子及雪旺

21、氏细胞的迁移进入管内进而作用于近 端，为有再生可能的神经元轴突提供了良好的条件和环境。同时胶原管本身的半通透性也有 助 于营养因子从周围环境中进入。因为胶原管在组织内可能被降解吸收，这个特性又可避免再 生神经纤维通过桥状物进入到对端后不再受到桥状物所可能产生的负作用，也排除了二次手 术取出的可能性。本实验中所用的IV/IVOX型胶原已在角膜移植、伤口愈合、硬脑膜修补及周围神经修复上 使用过，并证明这种物质可允许细胞迁移及生存并能接收保存神经营养因子于其 管内及壁内，因而能有效地促进轴突再生。术后9个月内未发现其它病理反应，说明了这种 物质无毒。管状物的修复还可在管内或管壁内人工加入神经营养因子

22、，如FGF，NT3，BDNF及 培养的雪旺氏细胞等，从而更好地促进轴突再生，因此表明胶原管是修复中枢到周围传导路 的良好生物材料。作者单位：刘松(海军总医院，100037北京)；刘宗惠(海军总医院，100037北京)；G.Said、M.Tadie(法国巴黎Le Kremli n Bicetre医疗中心) 参考文献1，Laquerriere A, Peulve P, Jin O, et al Effect of basic fibrob last growth factor and amelanocyte stimulation hormone of nerve regeneration thr

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