宏基因组实验计划.

1、宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划起草人：李浩宇宏基因组学研究方向及意义研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。发掘：环境应激和应答基因的多态性。探究：多态性基因的功能。实验大体步骤：克It霍解诜*冏cd片那廿离提聲诜（初叩血负I. 环境样品的采集：1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。2）样品的迅速处理保存。 有条件最好用液氮冷冻运输， 没有条件可以将装有样品的容器至 于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液（多为PBS）重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者-80 °C冰箱中，避免反复冻融。3）如果后续用间

2、接法提取总 DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差 速离心，一般适用于水样。II.DNA 提取方法的选择：总 DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为 直接提取法 和 间接提取法 。 直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的 DNA 。间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同， 各自都有优缺点。直接提取法的优缺点 ：直接提取法多用在提取固体样品（如土壤、污泥、湖泊沉积物等 ） 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。 造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的

3、胞外DNA ；二是许多微生物与基质形成复杂的结构， 间接提取法不易对其进行分离。 在样品较珍贵时多 采用此法。其缺点同样明显，所得 DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质 一并被保留下来，使得所得 DNA 呈现黄褐色甚至黑色。可以考虑 MoBio 和 Epicentre 的 DNA 提取的商业试剂盒 （主要用于提取土壤样品 ）。间接提取法的优缺点 ：间接提取法则既可以用来提取固相样品总 DNA 也可以用来提取液体 样品总 DNA 。在提取液体样品 （如海水、 河流等样品 ）总 DNA 时， 需要用抽滤的方式浓缩。 与直接提取法刚好相反， 其最大的优点在于提取 DNA 纯度高， 既

4、使在提取固体样品微生物 总 DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是 DNA 得率低。土壤 DNA 直接提取法：(1) 从超低温冰箱中取出保存样品(5 g)；(2) 于室温融化； 加入13.5 ml CTAB抽提缓冲液和50匕蛋白酶K贮存液；(4) 离心管于 37oC 225 rpm 水平振荡 30 min ；(5) 加入 1.5 mL20%SDS ；65oC水浴2 h,每隔15 min轻轻颠倒数次；(7) 室温 6,000g 离心 10 min ，收集上清液，转移至一个新的 50 ml 离心管中；(8) 沉淀中再加入4.5 ml提取液和0.5 ml 20

5、%SDS，轻轻涡旋至混匀；(9) 浸入液氮中冷冻 3 min 后,于沸水中煮沸 3 min；(10) 室温6,000g离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；(11) 重复 (8)、(9)、(10)一次；(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v)混合，摇匀后于 4 C12,000g 离心 10 min；(13) 将上层水相转移至一新的 50 ml 离心管中,加入等体积的氯仿：异戊醇 (24:1), 混匀后于4 °C 12,000g离心10 min ；(14) 再次转移上清至一新的离心管中,加入 0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀 1 h；(15) 室温

6、 12,000g 离心 20 min；(16) 收集沉淀,用预冷的 70%乙醇洗涤沉淀；(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 C放置过夜，分装保存于-20 C。实验过程中的注意事项及一些技巧：(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外 )。(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。(3) 酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到,宁可多丢弃一些。(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温, 0.7 倍体积室温沉淀足够了。(5) DNA 溶解时可以放在 4C 静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。水样 DNA 间接提取法：(1)

7、 抽滤的方式浓缩采集到的水样。(2) 采取差速离心取得水样中的菌体。(3) 取得微生物后进行裂解提取。此方法还在查证中,具体前期对样品的处理方法还在整理中。 例如：用多少的水样进行浓缩,差速离心的转速选择。 会不会有 DNA 的丢失等等。Epicentre 推出了宏基因组 DNA 分离试剂盒(Metagenomic DNA Isolation Kit for Water ),能 从水样中分离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。4Okb大小的Epicentre 的 PCC1FOS此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取DNA。提取的DNA可立即进行末端修

8、复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到 载体上。优势：1无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。2无需纯化柱或酚/氯仿提取。3产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。4.Fosmid载体与DNA的克隆只需要90分钟。F图为方法与流程:Him &工冲 ¥粗提 DNA 的纯化 采用直接提取法提取的总 DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。 它的存在对后续的分子生物 学操作会有影响， 时常会导致 PCR 扩增不出来， 酶切困难， 连接转化率低。 需要进行纯化。 纯化的方法包括：胶回收，柱纯化，电泳 /电洗脱，梯度离心。a 胶回收胶回收最大的优点在于快捷， 可以在很短的时间内完成。 纯化后的

9、 DNA 往往能够满足 PCR 要求。但其缺点在于， 膜截留式的纯化方式难免会对 DNA 分子造成机械损伤， 使得 DNA 弥 散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA ，则这种纯化方式不失为一种好方法。b 柱纯化柱纯化相对于胶回收来说更为快速， 十几分钟内可完成。 与胶回收相比， 其纯化效果要差一 些。但通常情况下，纯化之后的 DNA 也能够满足 PCR 需求。这种方法也会造成 DNA 分 子的机械损伤，使得 DNA 弥散，完整度下降。c 电泳 /电洗脱电泳 /电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一，其价格低；其二，整个过程都很温和，能 够保证 DNA 的完整性；其三，纯化后的

10、DNA 纯度较之前两种要好一些。但是其亦有些许 不便：其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二， DNA 损 失量较前两种大， 透析袋上会残留 DNA 。如果样品不是很珍贵， 并且后续要进行 Metagenomic 研究， 这种方法不失为一种好方法。 如果有脉冲场凝胶电泳系统， 用此方法可以得到高纯大 片段 DNA ，可以满足后续的 metagenomic C/Fosmid 文库构建。d 蔗糖 /氯化铯密度梯度离心如果实验室有超速离心机 （100,000g 以上 ），那么这种方法无疑也是一种好方法。与电泳电 洗脱法相同，这种方法在连续介质中对 DNA 及杂质进行分离，可

11、以很好的纯化 DNA 。纯 化得到的 DNA 经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的 DNA ，可以满足 后续的 metagenomic C/Fosmid 文库构建。纯化质量的检测DNA 纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一，完整 度判断；其二，纯度判断。a 完整度判断完整度判断同前所述， 千万要记得的是加纯化之前的 DNA 样品做对照。 结果可以告诉我们 纯化得率及完整度。同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。b 纯度判断 纯度判断通常可以采用两种方法：分光光度计法和 PCR 扩增法。分光光度计可以测定双链 DNA 在 260nm 处的吸收值及杂质在其他波

12、长的吸收值。通过不同波长吸收值的比，可以 对 DNA 纯度做出判定。通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。III. 所提 DNA 完整性检测DNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。最好采用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳， 低电压长时间跑。至少要用 lambda DNA/Hind III 做 marker ，如果在 23 kb 处有一条完整或 略拖尾的带， 则证明 DNA 完整性尚好。 如有条件， 可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整 lambda DNA （约 48 kb）充当另一个

13、 maker。以上为送测序前样品的采集， DNA 的提取，验证等前期处理与方法 的大致步骤与方法。Illumina 所进行的测序是 由 Genome Analyzer测序仪所完成的：Genome Analyzer技术的基本原理：仁文库制备将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的 小片断，在片断的两个末端加上接(adapter)2. 产生DNA簇利用专利的芯片，具表面连接有-层单链引 物,DNA片断成单链后通过与芯片表面的引物碱 基互补被一端“固泄”在芯片上。引物扩增使得单链 DNA成为双链，该双链变性后成为单链,貝一端'固 定”在芯片上，另外一端(5或3')随机和附近的另 外一

14、个引物互补，也被倘定住L形成淅(bridge) 反复30轮扩增，每个单分子得到了 1000倍扩 增，成为单克隆DNA簇”3. 测序四种荧光标记的染料应用边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理，在每个循 坏过程里，荧光标记的核昔和聚合酚被加入到单分 子阵列中。互补的核昔和核昔酸片断的第一个碱基 配对，通过酶加入到引物上。多余的核昔被移走。 这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被 延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光索酚, 对通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐 来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光 激发结合上的核昔的标记，这个标记会释放出荧 光。

15、荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵 列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述 的结合，检测町以重复几十个循环，这样就有可能 决定核昔酸片断中的几十个碱基。4. 数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进 行二次分析。Genome Analyzer的技术优势：1对扩展的超高通量Genome Analyzer系统每次配对末端运行后 对以得到超过3GB的高品质过滤数据。这个技术 的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更 少的经费完成更复杂的项冃。2.需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至 100ng,能应用在很多样晶有限的实验（比如免疫 沉淀、显微切割等

16、）中。3简单、快速、自动化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁 的工作流程。即使是最小的实验室也能像基因组中 心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几 小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数 据。Cluster Station 可以说是 Genome Analyzer 的核心。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过 程可以在5小时之内（30分钟手工操作）完成， 并同时处理8个样胡。这个自动化的流程不需要进 行油包水PCR,减少了手工操作误差和污染可能 性，不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流程 使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化 步移降低了项冃的时

17、间和费用。4.新颖的测序化学技术Genome Analyzer通过合成测序来支持人规 模并行测序。利用新颖的可逆荧光标记终止子，可 以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由 于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在， 自然的竞争减少了掺入的误差。5. 高产量的有效数据测序系统产生的原始数据的质量是评价实验 是否成功的最重要因索。川umina Genome Analyzer系统在一个配对末端运彳亍之后能产生超 过3GB的碱基数。高质量的数据以及每个碱基的 质量度量，意味着町以用更少的运行和更大的信心 来完成这个实验。6. 单个或配对末端支持Genome Analyzer系统支持单个片段或配对 末端文库。文库构建过程简单，减少了样品分离和 制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对 末端文库需要6个小时，只有3个小时需要手工操作。2x36个碱基或更长的片段增加了比对基囚组的能力，并拓展了在其他方面的应用。7. DNA分析支持Illumina提供了测序系统的分析软件和硬件， 用于从原始数据中快速获得町发表的、生物学有意 义的结果。IPAR （整合的初级分析和报告）系统 提供了初级数据输出的实时图像分析。图像分析之 后，Pipeline软件自动进行碱基读取和与参考序列 进彳亍比对。BeadStudio单元针对