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文档简介
1、RAW264.7细胞株的相关信息ATCC: 美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形, 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于70,隔夜后,移到液氮)。 2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask 均加满培养基。2.1. 检查flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。2.2.
2、0; 将原封之T25 flask 静置于37, 5% CO2 培养箱中,使细胞回温至37,并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。2.3. 隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5-10ml 培养基于flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。贴壁特别牢固。2、RAW264.7具有很强的吞噬能
3、力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这是培养这种细胞时最需要注意的问题。4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长,片片之间不连接,等到长到更多更密的时候会连成大片,并且会叠加成层。所以,要很好地控制好细胞的生长速度,不要等到叠加成层的时候再传代。5
4、、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉。二、RAW264.7细胞传代1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉, 然后用D-Hanks液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶的消化作用)2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加0.4ml, 37度消化5min,镜下看到细胞变圆,间隙增大。(值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感)3)立即加含10%FCS的培养液终止消化,用细胞刮刀
5、轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞的损伤极小4)离心,弃上清,加新的培养液(10%FCS),小心吹匀,分装入新的培养瓶三、RAW264.7细胞冻存及复苏(一)细胞冻存1. 配制冻存培养液;(通用的为培养基:血清:DMSO=7:2:1,但其中的血清可进行调整,如上面的仁兄用的4:5:1,比例过高)2. 取对数生长期的细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;3. 离心1000rpm,5min;4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细
6、胞的最终密度为5×106/ml1×107/ml;5. 将细胞分装入冻存管中,每管11.5 ml(不超过冻存管容量的80%);6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min;当温度达-25以下时,可增至-5-10/min;到-100时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ,然后放入-70冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。(具体操作为4°C 20min,-20°C30min,-70过夜,转入液氮中)(二) 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37温水中,并不时
7、摇动令其尽快融化。(1min以内溶解完毕,不能将口进入水面下)2. 从37水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;3. 离心, 1000rpm,5min;4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)5. 次日更换一次培养液,继续培养。(可更换一半培养液,避免跨度太大,影响细胞状态)(三)接种四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法1.倒掉旧的培养基,加入3ml新的培养基(有无血清的都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml的培养基,进行预吹打
8、,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。 2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次,20分钟,30分钟观察一次。选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁的情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中的培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。3.如果一次效果还不理想,可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意,结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。不
9、明之处:培养之前,一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。(200-250烘烤4-6h)?RAW264.7细胞株Cell Culture的材料(一)仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱(4、-20、-70)5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱(二)玻璃器皿1. 吸管(弯头、直头)2. 培养瓶3. 玻璃瓶(250ml、100ml)4. 废液缸(三)塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管(10ml)5. 15ml离心管6. 冻存管(12ml)(四)其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪(五
10、)试剂1. D-Hanks液2. 胎牛血清3. 培养液4. 双抗(青霉素、链霉素)5. 胰蛋白酶(0.25%)6.7.4%NaHCO37. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油附1. 胎牛血清品牌整理第一类,最高级别,是专门用于干细胞的特级胎牛血清1、Hyclone的特级胎牛血清目前,性能最好的血清,还是要说说Hyclone的特级胎牛血清,货号是SH30070.03,它是Hyclone的“招牌菜”。Hyclone特级胎牛血清(Defined FBS),货号SH30070,是世界上唯一经过40纳米过滤的顶级胎牛血清,极佳的促细胞生长作用及产品稳定性。内毒素含量10EU/ml,血红蛋白含量10mg/d
11、l。此血清可以广泛用于各种细胞培养,包含任何干细胞系的培养。2、Gibco的特级胎牛血清稍次一点的是Gibco公司在美国原装生产的特级胎牛血清,这款血清,货号是16000-044,是100nm过滤3次,内毒素和血红蛋白含量都可以与Hyclone的SH30070.03相媲美。也可以用于培养大部分的干细胞系。同样是美国来源,所以渠道特殊。3.TCB的特级胎牛血清TCB(Tissue Culture Biologicals)公司作为一家生物行业类的著名供应商,成立于1978年,大部分血清的采集和加工都在加利福尼亚。每一批的原材料都经过严格筛选,所有的产品都在FDA认证的cGMP车间进行!4. Bio
12、ind特优级胎牛血清血源来自北美和澳大利亚BioInd公司的生产完全符合GMP的要求,并通过ISO9000:2001和ISO 13485:2003质量认证。以安全,稳定,高效为原则的BioInd公司,所有的产品质量均完全符合国际标准。Biological Industries主营细胞培养类产品,BioInd工厂加工的胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。根据美国农业部标准,原始血清均采自未发生疯牛病(BSE)和口蹄疫(FMD)疫情的国家。Biological Industries三步滤菌处理法,最后的过滤步骤为连续通过三个100纳米的滤膜。血清生产的洁净级别为100级。所有分装工作台都通过
13、高效微粒空气过滤器过滤,并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。分装之后,终产品迅速-20度冻存,并隔离,直到所有的质量控制检测完成。第二类,优等胎牛血清1.Hyclone的加拿大优等胎牛血清性价比最高的是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396.03 血清采自加拿大,由hyclone公司总部的员工采集加工,采集方法,加工过程,检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致,市场价格低于美国原产的。经过3次100nm过滤,内毒素含量25EU/ml,血红蛋白含量25mg/dl2、Hyclone的南美优级胎牛血清大体与加拿大的优等血清是一样的,级
14、别也非常相似,货号是sv30087.02,该胎牛血清来源于南美洲,以封闭的心脏穿刺方式采集,产品经3次100nm 过滤,经严格检测确保无支原体,细菌病毒检测依据美国药典(USP)和美国联邦法规第九篇(9CFR),内毒素含量10 EU/ml,血红蛋白含量20 mg/dl,完全符合美国 HyClone® 优等胎牛血清的检测标准。3、Gibco的澳大利亚胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也是3200元/500ml左右。这一级别的血清,也能用于干细胞培养,可是,不象特级胎牛血清那么优秀。因为,此胎牛血清属于澳大利亚生产的,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受
15、到任何影响,所以,就目前而言,算是最好的胎牛血清了,有不少客户都此血清来培养干细胞,效果还是比较不错。4、TCB的优级胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也是2300元/500ml左右。这一级别的血清,也能用于干细胞培养,可是,不象特级胎牛血清那么优秀。第三类,一般级别的进口胎牛血清1、Hyclone的南美胎牛血清目前,市场上用的最多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ,此血清采自南美,在国内(兰州)过滤并测试检验,经三次100纳米过滤,根据中国商标法的规定标贴中文标签,内毒素含量10EU/ml,血红蛋白含量20mg/d。此血清广泛用于各种肿瘤细
16、胞的培养,还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用于干细胞培养的,不过,因为本身血红素比较高,所以,最好不要用于干细胞,2、Gibco的南美胎牛血清这款血清,是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做的,价格比较贵,好像是1780元/500m。3、Gemini的胎牛血清4、TCB的胎牛血清5、PAA的胎牛血清6、JRH澳洲胎牛血清第四类,国产的各种系列胎牛血清国产的胎牛血清,国内没有严格意义的胎牛血清,胎牛血清本身是需要穿刺取血的,而国内都是剖腹产出胎牛,8小时左右取血,然后,进行过滤分装。所以,国产的胎牛血清不是严格意义的胎牛血清。价格便宜但是遇到的问题非常多。附2. Hyclone
17、液体培养基普通液体培养基列表描述货号包装储存温度BME培养基(Basal Medium Eagle)EBSS*,含L-谷氨酰胺。 SH30157.01500 ml2-8°C SH30157.021000 ml2-8°CDMEM培养基(Dulbeccos Modified Eagles Medium)高糖,含4.0 mM L-谷氨酰胺,不含丙酮酸钠。 SH30022.01B500 ml2-8°C SH30022.FS6 x 500 ml2-8°C SH30022.02B1000 ml2-8°C SH30022.LS6 x 1000 ml2-8
18、176;C高糖,不含L-谷氨酰胺与丙酮酸钠。 SH30081.01500 ml2-8°C SH30081.FS6 x 500 ml2-8°C SH30081.021000 ml2-8°C SH30081.LS6 x 1000 ml2-8°C SH30081.0320 L袋装2-8°C SH30081.0410 L袋装2-8°C高糖,含4.0 mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠。SH30243.01B500 ml2-8°CSH30243.FS6 x 500 ml2-8°CSH30243.021000 ml2-8°
19、CSH30243.LS6 x 1000 ml2-8°CSH30243.0310 L袋装2-8°CSH30243.0420 L袋装2-8°C高糖,含L-谷氨酰胺、HEPES,不含丙酮酸钠。SH30249.01500 ml2-8°CSH30249.021000 ml2-8°C高糖,不含钙、镁。SH30262.01500 ml2-8°CSH30262.021000 ml2-8°C高糖,含L-谷氨酰胺,不含酚红与丙酮酸钠。SH30284.01500 ml2-8°CSH30284.021000 ml2-8°C高糖,
20、含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺。SH30285.01500 ml2-8°CSH30285.FS6 x 500 ml2-8°CSH30285.021000 ml2-8°CSH30285.LS6 x 1000 ml2-8°CSH30285.0320 L袋装2-8°CSH30285.0410 L袋装2-8°C高糖,改良型,不含酚红、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。SH30585.01500 ml2-8°CSH30585.021000 ml2-8°C高糖,改良型,不含酚红、L-谷氨酰胺,含丙酮酸钠。SH30604.01500 ml2
21、-8°CSH30604.021000 ml2-8°C高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。SH30606.01500 ml2-8°CSH30606.021000 ml2-8°C高度改良,含丙酮酸钠、25 mM HEPES,不含L-谷氨酰胺。SH30563.01500 ml2-8°CSH30563.021000 ml2-8°C高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺、磷酸盐。SH30607.01500 ml2-8°C低糖,含4.0 mM L-谷氨酰胺、110 mg丙酮酸钠。SH30021.01B500 ml2-8
22、176;CSH30021.FS6 x 500 ml2-8°CSH30021.021000 ml2-8°C含2.50 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES。SH30023.01B500 ml2-8°CSH30023.FS6 x 500 ml2-8°CSH30023.021000 ml2-8°C含HEPES,不含L-谷氨酰胺。SH30126.01500 ml2-8°CSH30126.FS6 x 500 ml2-8°CSH30126.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸钠。SH30261.
23、01500 ml2-8°CSH30261.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺,不含HEPES。SH30271.01500 ml2-8°CSH30271.FS6 x 500 ml2-8°CSH30271.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺,不含HEPES、酚红。SH30272.01500 ml2-8°CSH30272.021000 ml2-8°CHam"s培养基 (Hams Nutrient Mixture)F10培养基,含L-谷氨酰胺。SH30025.01500 ml2-8°CSH3002
24、5.021000 ml2-8°CF12培养基,含1.00 mM L-谷氨酰胺。, 1XSH30026.01B500 ml2-8°CSH30026.FS6 x 500 ml2-8°CSH30026.021000 ml2-8°CF12培养基, Kaighn"s改良型。SH30526.01500 ml2-8°CSH30526.021000 ml2-8°C昆虫培养基 (Insect Media)Grace"s无添加剂培养基SH30610.01500 ml2-8°CSH30610.021000 ml2-8°
25、;CTNM-FH培养基SH30280.02500 ml2-8°CSH30280.031000 ml2-8°CIMDM培养基 (Iscove"s Modified Dulbecco"s Medium)含L-谷氨酰胺、HEPES,不含-硫代甘油。SH30228.01B500 ml2-8°CSH30228.FS6 x 500 ml2-8°CSH30228.021000 ml2-8°C不含L-谷氨酰胺。SH30259.01500 ml2-8°CSH30259.021000 ml2-8°CLeibovitz培养基
26、(Leibovitz Medium)L-15培养基,含2.05 mM L-谷氨酰胺。SH30525.01500 ml2-8°CSH30525.021000 ml2-8°CM199培养基 (Medium 199)EBSS*,含L-谷氨酰胺。SH30253.01B500 ml2-8°CSH30253.FS6 x 500 ml2-8°CSH30253.021000 ml2-8°CHBSS*,含L-谷氨酰胺。SH30233.01100 ml2-8°CSH30233.02500 ml2-8°CHBSS*,含L-谷氨酰胺、L-氨基酸。S
27、H30330.01500 ml2-8°CSH30330.021000 ml2-8°CMcCoy"s 5A培养基 (McCoy"s 5A Medium)含L-谷氨酰胺。SH30200.01500 ml2-8°CSH30200.FS6 x 500 ml2-8°CSH30200.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺,不含酚红。SH30270.01500 ml2-8°CSH30270.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺、HEPES。SH30602.01500 ml2-8°CSH30602.
28、021000 ml2-8°CSH30602.03100 ml2-8°CMEM 培养基(Minimum Essential Medium)EBSS*,含2.0 mM L-谷氨酰胺。SH30024.01B500 ml2-8°CSH30024.FS6 x 500 ml2-8°CSH30024.021000 ml2-8°CSH30024.LS6 x 1000 ml2-8°CEBSS*,含L-谷氨酰胺,用于悬浮培养。SH30235.01500 ml2-8°CSH30235.021000 ml2-8°CEBSS*,不含L-谷氨
29、酰胺。SH30244.01500 ml2-8°CSH30244.FS6 x 500 ml2-8°CSH30244.021000 ml2-8°CSH30244.LS6 x 1000 ml2-8°C改良型,含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。SH30265.01B500 ml2-8°CSH30265.021000 ml2-8°CSH30265.FS6 x 500 ml2-8°C改良型,不含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。SH30568.01500 ml2-8°CSH30568.FS6 x 500 ml2-8°CSH30568.021000 ml2-8°CRichter"s改良型,不含酚红。SH30600.01500 ml2-8°CSH30600.02 1000 ml2-8°CRichter"s改良型,含L-谷氨酰胺、酚红。SH30601
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