RAW小鼠巨噬细胞protocol

1、RAW264.7细胞株的相关信息ATCC: 美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于70，隔夜后，移到液氮)。 2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。2.1.  检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2.2.

2、0; 将原封之T25 flask 静置于37， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。2.3.  隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。2、RAW264.7具有很强的吞噬能

3、力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。5

4、、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。二、RAW264.7细胞传代1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉， 然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml， 37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。（值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感）3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀

5、轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶三、RAW264.7细胞冻存及复苏（一）细胞冻存1. 配制冻存培养液；（通用的为培养基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可进行调整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例过高）2. 取对数生长期的细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细

6、胞的最终密度为5×106/ml1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml（不超过冻存管容量的80%）；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（具体操作为4°C 20min，-20°C30min，-70过夜，转入液氮中）（二） 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时

7、摇动令其尽快融化。（1min以内溶解完毕，不能将口进入水面下）2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；(复苏时细胞密度稍大，可提高复苏效率)5. 次日更换一次培养液，继续培养。（可更换一半培养液，避免跨度太大，影响细胞状态）（三）接种四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法1.倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打

8、，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。 2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。3.如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。不

9、明之处：培养之前，一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。（200-250烘烤4-6h）？RAW264.7细胞株Cell Culture的材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4、-20、-70）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（12ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五

10、）试剂1. D-Hanks液2. 胎牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.25%）6.7.4%NaHCO37. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油附1. 胎牛血清品牌整理第一类，最高级别，是专门用于干细胞的特级胎牛血清1、Hyclone的特级胎牛血清目前，性能最好的血清，还是要说说Hyclone的特级胎牛血清，货号是SH30070.03，它是Hyclone的“招牌菜”。Hyclone特级胎牛血清（Defined FBS），货号SH30070，是世界上唯一经过40纳米过滤的顶级胎牛血清，极佳的促细胞生长作用及产品稳定性。内毒素含量10EU/ml，血红蛋白含量10mg/d

11、l。此血清可以广泛用于各种细胞培养，包含任何干细胞系的培养。2、Gibco的特级胎牛血清稍次一点的是Gibco公司在美国原装生产的特级胎牛血清，这款血清，货号是16000-044，是100nm过滤3次，内毒素和血红蛋白含量都可以与Hyclone的SH30070.03相媲美。也可以用于培养大部分的干细胞系。同样是美国来源，所以渠道特殊。3.TCB的特级胎牛血清TCB（Tissue Culture Biologicals）公司作为一家生物行业类的著名供应商，成立于1978年，大部分血清的采集和加工都在加利福尼亚。每一批的原材料都经过严格筛选，所有的产品都在FDA认证的cGMP车间进行！4. Bio

12、ind特优级胎牛血清血源来自北美和澳大利亚BioInd公司的生产完全符合GMP的要求，并通过ISO9000:2001和ISO 13485:2003质量认证。以安全，稳定，高效为原则的BioInd公司，所有的产品质量均完全符合国际标准。Biological Industries主营细胞培养类产品，BioInd工厂加工的胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。根据美国农业部标准，原始血清均采自未发生疯牛病（BSE）和口蹄疫（FMD）疫情的国家。Biological Industries三步滤菌处理法，最后的过滤步骤为连续通过三个100纳米的滤膜。血清生产的洁净级别为100级。所有分装工作台都通过

13、高效微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。分装之后，终产品迅速-20度冻存，并隔离，直到所有的质量控制检测完成。第二类，优等胎牛血清1.Hyclone的加拿大优等胎牛血清性价比最高的是Hyclone加拿大优等胎牛血清（CharacterizendFBS）SH30396.03 血清采自加拿大，由hyclone公司总部的员工采集加工，采集方法，加工过程，检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致，市场价格低于美国原产的。经过3次100nm过滤，内毒素含量25EU/ml，血红蛋白含量25mg/dl2、Hyclone的南美优级胎牛血清大体与加拿大的优等血清是一样的，级

14、别也非常相似，货号是sv30087.02，该胎牛血清来源于南美洲，以封闭的心脏穿刺方式采集，产品经3次100nm 过滤，经严格检测确保无支原体，细菌病毒检测依据美国药典（USP）和美国联邦法规第九篇（9CFR），内毒素含量10 EU/ml，血红蛋白含量20 mg/dl，完全符合美国 HyClone® 优等胎牛血清的检测标准。3、Gibco的澳大利亚胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是3200元/500ml左右。这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清那么优秀。因为，此胎牛血清属于澳大利亚生产的，不在疫区，可以正常报关进口，目前没有受

15、到任何影响，所以，就目前而言，算是最好的胎牛血清了，有不少客户都此血清来培养干细胞，效果还是比较不错。4、TCB的优级胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是2300元/500ml左右。这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清那么优秀。第三类，一般级别的进口胎牛血清1、Hyclone的南美胎牛血清目前，市场上用的最多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在国内（兰州）过滤并测试检验，经三次100纳米过滤，根据中国商标法的规定标贴中文标签，内毒素含量10EU/ml,血红蛋白含量20mg/d。此血清广泛用于各种肿瘤细

16、胞的培养，还没有资料记载能够用于干细胞，也听说有少数人用于干细胞培养的，不过，因为本身血红素比较高，所以，最好不要用于干细胞，2、Gibco的南美胎牛血清这款血清，是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做的，价格比较贵，好像是1780元/500m。3、Gemini的胎牛血清4、TCB的胎牛血清5、PAA的胎牛血清6、JRH澳洲胎牛血清第四类，国产的各种系列胎牛血清国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤分装。所以，国产的胎牛血清不是严格意义的胎牛血清。价格便宜但是遇到的问题非常多。附2. Hyclone

17、液体培养基普通液体培养基列表描述货号包装储存温度BME培养基(Basal Medium Eagle)EBSS*，含L-谷氨酰胺。 SH30157.01500 ml2-8°C SH30157.021000 ml2-8°CDMEM培养基(Dulbeccos Modified Eagles Medium)高糖，含4.0 mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠。 SH30022.01B500 ml2-8°C SH30022.FS6 x 500 ml2-8°C SH30022.02B1000 ml2-8°C SH30022.LS6 x 1000 ml2-8&#

18、176;C高糖，不含L-谷氨酰胺与丙酮酸钠。 SH30081.01500 ml2-8°C SH30081.FS6 x 500 ml2-8°C SH30081.021000 ml2-8°C SH30081.LS6 x 1000 ml2-8°C SH30081.0320 L袋装2-8°C SH30081.0410 L袋装2-8°C高糖，含4.0 mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠。SH30243.01B500 ml2-8°CSH30243.FS6 x 500 ml2-8°CSH30243.021000 ml2-8°

19、CSH30243.LS6 x 1000 ml2-8°CSH30243.0310 L袋装2-8°CSH30243.0420 L袋装2-8°C高糖，含L-谷氨酰胺、HEPES，不含丙酮酸钠。SH30249.01500 ml2-8°CSH30249.021000 ml2-8°C高糖，不含钙、镁。SH30262.01500 ml2-8°CSH30262.021000 ml2-8°C高糖，含L-谷氨酰胺，不含酚红与丙酮酸钠。SH30284.01500 ml2-8°CSH30284.021000 ml2-8°C高糖，

20、含丙酮酸钠，不含L-谷氨酰胺。SH30285.01500 ml2-8°CSH30285.FS6 x 500 ml2-8°CSH30285.021000 ml2-8°CSH30285.LS6 x 1000 ml2-8°CSH30285.0320 L袋装2-8°CSH30285.0410 L袋装2-8°C高糖，改良型，不含酚红、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。SH30585.01500 ml2-8°CSH30585.021000 ml2-8°C高糖，改良型，不含酚红、L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠。SH30604.01500 ml2

21、-8°CSH30604.021000 ml2-8°C高糖，含丙酮酸钠，不含L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。SH30606.01500 ml2-8°CSH30606.021000 ml2-8°C高度改良，含丙酮酸钠、25 mM HEPES，不含L-谷氨酰胺。SH30563.01500 ml2-8°CSH30563.021000 ml2-8°C高糖，含丙酮酸钠，不含L-谷氨酰胺、磷酸盐。SH30607.01500 ml2-8°C低糖，含4.0 mM L-谷氨酰胺、110 mg丙酮酸钠。SH30021.01B500 ml2-8&#

22、176;CSH30021.FS6 x 500 ml2-8°CSH30021.021000 ml2-8°C含2.50 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES。SH30023.01B500 ml2-8°CSH30023.FS6 x 500 ml2-8°CSH30023.021000 ml2-8°C含HEPES，不含L-谷氨酰胺。SH30126.01500 ml2-8°CSH30126.FS6 x 500 ml2-8°CSH30126.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸钠。SH30261.

23、01500 ml2-8°CSH30261.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺，不含HEPES。SH30271.01500 ml2-8°CSH30271.FS6 x 500 ml2-8°CSH30271.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺，不含HEPES、酚红。SH30272.01500 ml2-8°CSH30272.021000 ml2-8°CHam"s培养基 (Hams Nutrient Mixture)F10培养基，含L-谷氨酰胺。SH30025.01500 ml2-8°CSH3002

24、5.021000 ml2-8°CF12培养基，含1.00 mM L-谷氨酰胺。, 1XSH30026.01B500 ml2-8°CSH30026.FS6 x 500 ml2-8°CSH30026.021000 ml2-8°CF12培养基, Kaighn"s改良型。SH30526.01500 ml2-8°CSH30526.021000 ml2-8°C昆虫培养基 (Insect Media)Grace"s无添加剂培养基SH30610.01500 ml2-8°CSH30610.021000 ml2-8°

25、;CTNM-FH培养基SH30280.02500 ml2-8°CSH30280.031000 ml2-8°CIMDM培养基 (Iscove"s Modified Dulbecco"s Medium)含L-谷氨酰胺、HEPES，不含-硫代甘油。SH30228.01B500 ml2-8°CSH30228.FS6 x 500 ml2-8°CSH30228.021000 ml2-8°C不含L-谷氨酰胺。SH30259.01500 ml2-8°CSH30259.021000 ml2-8°CLeibovitz培养基

26、(Leibovitz Medium)L-15培养基，含2.05 mM L-谷氨酰胺。SH30525.01500 ml2-8°CSH30525.021000 ml2-8°CM199培养基 (Medium 199)EBSS*，含L-谷氨酰胺。SH30253.01B500 ml2-8°CSH30253.FS6 x 500 ml2-8°CSH30253.021000 ml2-8°CHBSS*，含L-谷氨酰胺。SH30233.01100 ml2-8°CSH30233.02500 ml2-8°CHBSS*，含L-谷氨酰胺、L-氨基酸。S

27、H30330.01500 ml2-8°CSH30330.021000 ml2-8°CMcCoy"s 5A培养基 (McCoy"s 5A Medium)含L-谷氨酰胺。SH30200.01500 ml2-8°CSH30200.FS6 x 500 ml2-8°CSH30200.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺，不含酚红。SH30270.01500 ml2-8°CSH30270.021000 ml2-8°C含L-谷氨酰胺、HEPES。SH30602.01500 ml2-8°CSH30602.

28、021000 ml2-8°CSH30602.03100 ml2-8°CMEM 培养基（Minimum Essential Medium）EBSS*，含2.0 mM L-谷氨酰胺。SH30024.01B500 ml2-8°CSH30024.FS6 x 500 ml2-8°CSH30024.021000 ml2-8°CSH30024.LS6 x 1000 ml2-8°CEBSS*，含L-谷氨酰胺，用于悬浮培养。SH30235.01500 ml2-8°CSH30235.021000 ml2-8°CEBSS*，不含L-谷氨

29、酰胺。SH30244.01500 ml2-8°CSH30244.FS6 x 500 ml2-8°CSH30244.021000 ml2-8°CSH30244.LS6 x 1000 ml2-8°C改良型，含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。SH30265.01B500 ml2-8°CSH30265.021000 ml2-8°CSH30265.FS6 x 500 ml2-8°C改良型，不含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。SH30568.01500 ml2-8°CSH30568.FS6 x 500 ml2-8°CSH30568.021000 ml2-8°CRichter"s改良型，不含酚红。SH30600.01500 ml2-8°CSH30600.02 1000 ml2-8°CRichter"s改良型，含L-谷氨酰胺、酚红。SH30601