低强度红激光局部照射影响血管损伤后重塑的实验研究

1、    低强度红激光局部照射影响血管损伤后重塑的实验研究        【摘要】目的评价低能量红激光局部照射(LPRLI)对血管损伤后重塑模式的影响。方法雄性新西兰白兔100只，随机分为球囊拉伤组和球囊拉伤加激光照射组。球囊拉伤右髂动脉后，应用激光球囊照射拉伤局部，总的能量密度为0.9 J/cm2。分别于术后3天、1周、2周、4周和8周分批处死动物，原位固定后截取病变血管进行病理组织学和免疫组织化学检测。最后1批动物在取材前进行髂动脉造影。结果拉伤后3天单纯拉伤组管腔横截面积

2、和外弹力板围绕面积明显低于激光照射组，管腔狭窄程度显著高于激光照射组(P0.05)；单纯拉伤组术后2周血管腔横截面积和外弹力膜围绕面积与术后3天相比有所增大(P0.05)，血管狭窄程度减轻(P0.05)，术后28周血管腔横截面积和外弹力膜围绕面积均进行性减小，狭窄程度逐渐加重(P0.05)。在8周时已显著小于正常血管外弹力膜围绕面积(P0.05)。激光组术后28周血管狭窄程度无明显变化(P0.05)，外弹力膜围绕面积进行性增大，到术后8周已显著大于正常血管的外弹力板围绕面积(P0.05)。术后1周内膜加中膜面积两组均出现明显增厚(P0.05)，从第2周开始，激光组内膜加中膜面积显著小于单纯拉伤

3、组(P0.05)。髂动脉造影结果显示，单纯拉伤组血管最小内径明显小于激光照射组(P0.01)；激光照射后血管狭窄程度显著减轻(P0.01)。结论激光局部照射可以显著改善血管损伤后重塑的建立模式，减少狭窄的发生。【关键词】低强度红激光再狭窄重塑 The role of low power red laser illumination on remodeling after arterial injury in normal rabbitsLi Guang, Chen Jiyan, Zhou Yingling, et al.（Guangdong Provincial Cardiovascular

4、Institute, Guangzhou 510100）【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of a certain density illumination of low power red laser on the remodeling after arterial injury. MethodOne hundred male New Zealand white rabbits were randomized into two groups: balloon injury group (control group) and ballo

5、on injury followed by laser illumination group (treatment group: total illumination density:0.9 J/cm2). To study the time course of morphological changes, all the animals were killed on 3,7,14,28 or 56 days respectively after the procedure and with local fixation the iliac arteries were harvested fo

6、r further pathomorphometrical analysis. At the end of 56 days, animals received angiography before killed. ResultsUnder microscope, the scores of iliac arterial injury were similar between the two groups( P0.05). On the third day after the procedure, recoils were seen in both groups, but the stenosi

7、s rate of balloon group were significantly higher than those of laser group (P0.05). The areas embayed by extral elastic membrane were altered synchronously with the lumen areas and it was smaller of balloon group than of laser group (P0.05). At the end of 2 weeks, the areas under extral elastic mem

8、brane in balloon group increased obviously compared with those of the normal arteries and the stenosis rate reduced compared with those on third day (P0.05). From 14 to 56 days, the areas of lumen and under extral elastic membrane were both reduced increasingly in balloon group and at the end of 56

9、days the later was smaller significantly than those of normal arteries. In laser group, the lumen areas showed no changes through the whole time but the areas embayed by extral elastic membrane increased gradually and at the end of 56 days they were significantly larger than those of normal arteries

10、. At the end of 56 days, the stenosis rate was significant higher in balloon group than those in laser group (P0.05). Iliac arterial angiography showed the minimal lumen dia-meters and lumen stenosis rates in laser group were significantly improved compared with those in balloon group (P0.01). Concl

11、usionLow power laser illumination in a certain density followed arterial injury could significantly improve the mode of arterial remodeling and reduce the arterial stenosis degrees after balloon injury.【Key words】Low power red laser Restenosis Remodeling血管重塑在经皮腔内冠脉成形术(PTCA)后再狭窄的形成中的作用越来越受到重视，而血管损伤后内

12、皮细胞的剥脱和修复障碍对血管重塑模式的建立有着重要影响1。低强度红激光照射(low power red laser illumination, LPRLI)具有促进细胞的再生和损伤组织修复作用2，一定能量密度的LPRLI可以促进EC的增殖和功能恢复3。本文旨在评价LPRLI对血管损伤后重塑模式建立的影响。材料与方法一、实验材料雄性新西兰白兔100只，体重2.53.0 kg。激光球囊导管(3.0 mm×20 mm. Global Therapeutic)、激光发生器(He-Ne Laser. Global Therapeutic)、普通PTCA导引钢丝和球囊导管(Medtronic 3

13、.0 mm×10 mm)、电脑像分析仪(Knotron IBAS 2.0)、Philips BC 3000双C臂心血管造影机。二、实验方法1.实验动物分组按照完全随机的方法将兔子分为单纯球囊拉伤组和球囊拉伤加激光照射组各50只。每组动物按照取材时间随机分成5个亚组：术后3天、1周、2周、4周和8周，每个亚组各10只。于拉伤前1周开始给予高脂饮食(5%的猪油、2%的胆固醇、其余为标准综合饲料)，术后继续喂养直到处死。1单纯拉伤组血管形态学变化2激光照射组血管形态学变化2.球囊拉伤与红激光照射应用PTCA球囊导管将家兔髂动脉拉伤后，插入激光球囊导管(采用带有200 m光纤和头端可以同轴辐

14、射样发射激光的球囊导管，3.0 mm×20 mm)，使球囊位于髂动脉拉伤处。维持压力2atm，开通激光，输出功率10 mW，照射60秒后，关闭激光并抽空球囊。1分钟后重复上述照射过程两次。每次持续照射1分钟，间隔一分钟。照射总的能量密度均为0.9 J/cm2。单纯拉伤组的处理除不进行激光照射外，其他与照射组相同。3.造影与病理组织学检查(1)造影：拉伤后8周经左颈总动脉切开，沿导丝插入4F普通右心导管到腹主动脉进行髂动脉造影检查，并用电影胶片进行记录。采用造影机电脑自带软件测定邻近正常血管腔内径、管腔最小内径和狭窄程度(与邻近正常管腔相比)，连续测量3次，计算平均值。(2)病理组织学

15、检查：分别于拉伤后3天、1周、2周、4周和8周进行髂动脉病理组织学检查。采用10%甲醛溶液原位固定髂动脉的方法4，留置血管标本并进行HE、弹力纤维染色和平滑肌-肌动蛋白单克隆抗体染色，应用光学显微镜和计算机像分析系统分析测定：管腔面积、内膜加中膜面积(外弹力板与管腔之间)和外弹力板围绕面积(包括管腔、内膜和中膜)，计算血管狭窄程度(与邻近正常血管相比)，血管损伤程度参考Schneider方法进行评分5。三、统计学分析两组之间的数据(±s）分析采用成组t检验、方差分析和完全随机区组设计分析方法，以P值小于0.05为差别有统计学意义。结果单纯拉伤组1只和激光照射组3只兔因球囊拉伤时血管破

16、裂死亡，另有1只兔因拉伤血管处血栓形成而闭塞。其余95只兔成功建立了动物模型并进行到实验终点。一、病理形态学分析病理形态学检查结果见附表。两组血管壁损伤程度积分相似(P0.05)；邻近正常血管的管腔横截面积两组间无统计学差异(P0.05)。平滑肌-肌动蛋白单克隆抗体染色显示血管中膜和增生的内膜充填的细胞浆呈棕黄色，表明主要的细胞成分为VSMC。拉伤后3天两组血管管腔横截面积和外弹力板围绕面积均出现明显减小，并且单纯拉伤组管腔横截面积和外弹力板围绕面积明显低于激光照射组(P0.05)，管腔狭窄程度显著高于激光照射组(P0.05)；单纯拉伤组术后2周血管腔横截面积与术后3天相比有所增大(P0.05

17、)，血管狭窄程度减轻(P0.05)，术后28周血管腔横截面积进行性减小，狭窄程度逐渐加重(P0.05)。单纯拉伤组术后2周外弹力膜围绕面积与正常血管相比显著增大(P0.05)，术后28周外弹力膜围绕面积出现减小趋势，在8周时已显著小于正常血管外弹力膜围绕面积(P0.05)。激光组术后28周血管狭窄程度无明显变化(P0.05)，外弹力膜围绕面积进行性增大，到术后8周已显著大于正常血管的外弹力板围绕面积(P0.05)。术后1周内膜加中膜面积两组均出现明显增厚(P0.05)，并呈进行性的加重。但是，从第2周开始两组间内膜加中膜面积显示明显差异(P0.05)，激光组内膜加中膜面积显著小于单纯拉伤组(P

18、0.05)，并且两组间内膜加中膜面积的差别随时间逐渐扩大。附表病理形态学检测结果(mm2)时间项目3天1周2周4周8周拉伤(n=9)激光(n=9)激光(n=9)拉伤(n=9)激光(n=9)拉伤(n=9)激光(n=9)拉伤(n=10)拉伤(n=9)激光(n=9)正常管腔面积*1.43±0.371.41±0.421.40±0.291.43±0.331.42±0.271.42±0.361.39±0.301.40±0.281.43±0.371.42±0.26管腔面积0.98±0.231.28&

19、#177;0.271.06±0.271.32±0.261.25±0.341.33±0.390.73±0.241.30±0.320.32±0.131.28±0.21管腔狭窄程度%38.75±6.428.67±1.7524.57±5.147.49±2.3611.28±2.436.08±1.5449.29±5.427.26±2.1376.53±9.629.64±3.88内膜+中膜面积0.42±0.14*0.41&

20、#177;0.20*0.49±0.19*0.48±0.23*0.72±0.340.54±0.270.95±0.480.62±0.251.25±0.450.76±0.37正常外弹力膜下面积*1.82±0.261.83±0.321.81±0.351.82±0.301.78±0.261.82±0.331.79±0.241.83±0.321.82±0.221.81±0.27外弹力膜下面积1.40±0.281.69&

21、#177;0.361.55±0.421.80±1.401.97±0.39*1.87±0.31*1.68±0.381.92±0.411.57±0.442.04±0.39血管损伤程度评分*2.50±0.712.40±0.522.50±0.532.40±0.702.44±0.762.33±0.502.40±0.522.60±0.702.57±0.732.44±0.53注：*组间无显著性差异P0.05;组间有显著性差异P0.

22、05;与正常相比有显著性差异P0.05。 二、血管造影定量分析术后第8周，髂动脉造影结果显示，邻近正常血管内径两组间无显著性差异(1.52±0.21 vs 1.48±0.17, P0.05)。单纯拉伤组血管最小内径明显小于激光照射组(0.57±0.17 vs 1.32±0.22, P0.01)；与邻近正常血管相比，狭窄程度两组间存在显著差异，激光照射后血管狭窄程度显著减轻(62.02%±13.23% vs 11.62%±8.24%，P0.01)。讨论一、LPRLl对血管重塑的影响以往对预防血管再狭窄的研究主要是针对于抑制VSMC的迁移

23、和增生，减少再狭窄的发生，但是效果并不理想。病理学和血管内超声研究发现，与单纯内膜VSMC的增生相比，血管的病理性重塑在再狭窄的发生机制中占有更重要的地位6。为了研究LPRLI对血管重塑的影响，我们分为5个不同的时间段，动态观察血管拉伤后重塑的形成情况以及LPRLI的影响。在血管取材时，采用在体同等压力灌注原位固定的方式4，确保病变血管保持原有在体时的形态，尽量减少因为取材和病理标本制作造成血管的变形，以便于进行血管形态学的分析。在进行计算机形分析时，测定血管外弹力膜围绕面积作为整个血管的横截面积，以其变化来反映血管形态学的重塑情况。以外弹力膜围绕面积减去管腔面积作为内膜加中膜面积，来反映VS

24、MC的增生程度。结果显示，在拉伤后3天，单纯拉伤组血管腔面积缩小了38.75%，而激光照射组管腔面积只减少16.59%，两组间存在显著的差异。但是此时内膜加中膜面积两组间没有显著性差别，与邻近正常血管壁相比，也没有明显的增厚。相反整个外弹力板下的面积两组均出现减小，与管腔面积减小的幅度相似。表明拉伤后血管舒张发生障碍，血管发生了回缩，而LPRLI对这种回缩起到了抑制作用。在拉伤后第2周，单纯拉伤组血管内膜出现了显著的增厚，管腔面积虽然小于正常血管腔面积，但是与第1周相比，狭窄程度反而减轻，外弹力膜围绕面积与正常血管相比，呈现出明显的扩大，血管发生了适应性的重塑。以后的4周和8周的病理组织学检测

25、显示单纯拉伤组血管内膜加中膜面积进行性增大，管腔面积进行性减小，同时外弹力板下面积也呈现出逐渐减小的趋势，到术后8周时已显著小于正常血管的外弹力膜围绕面积，整个血管由适应性重塑转变为病理性重塑现象。激光照射组在拉伤后第2周管腔面积与第1周相比没有显著性差异，外弹力膜下面积出现增大趋势，统计学分析未发现显著性。在28周的时间内，激光照射组同样出现血管内膜加中膜面积逐渐增厚，增厚程度显著小于单纯拉伤组，更重要的是激光照射后血管管腔面积随时间没有明显的变化，外弹力板下面积却逐渐增大，并在第8周时已明显大于正常血管的外弹力膜下面积，血管表现出一种缓慢的适应性重塑。与单纯拉伤组相比，两组血管外弹力膜围绕

26、面积的动态变化曲线出现了显著的差异，因此，我们推测LPRLI改变了损伤血管重塑的建立模式，抑制了血管的病理性重塑或者是促进了血管的适应性重塑，这是以往在预防再狭窄的实验研究中很少注意到的现象。血管造影显示术后第8周激光照射组血管最小内径显著大于单纯拉伤组，血管狭窄程度明显减轻，与病理形态学分析结果一致，从不同角度表明了LPRLI对血管损伤后狭窄的预防作用。二、LPRLI预防再狭窄机制的初步探讨过去，低强度激光照射主要用于促进创伤后或皮肤粘膜溃疡的组织修复。后来，John和Kipshidze等7，8研究发现LPRLI后VSMC的非内皮依赖性的收缩功能明显受到抑制，细胞发生变性坏死，而局部的温度改

27、变只在1.2以内，因此可以完全排除激光的热损伤。在进一步的在体动物实验证实，一定能量密度(1.5 J/cm2)的LPRLI可以通过抑制和杀伤VSMC，显著减少血管成形术后再狭窄的发生。但是过量的VSMC的破坏可能会形成局部的血管瘤；另外，过多的VSMC破坏后可以释放出大量的成纤维细胞生长因子，引起残存的和损伤周围的VSMC的迁移和增生，从而影响红激光的疗效。Kipshidze进一步应用不同能量密度的He-Ne红激光照射离体培养的兔和人的VSMC和EC9，当照射的能量密度在1.0 J/cm2以下时，血管内皮细胞的活性增强，生长和增殖加快，但是VSMC的活性并没有明显的改变。增加照射的能量密度，首

28、先表现出EC的活性受到抑制，说明EC与VSMC相比对LPRLI更敏感。此外，Kara的研究表明，低能量密度的红激光照射可以显著地提高EC的黏附能力，这对于EC的增生和修复是至关重要的。在以上研究的基础上，我们进行了血管损伤后局部给予更低能量密度的红激光照射(0.9 J/cm2)的在体动物实验。结果显示LPRLI可明显减少血管损伤后早期的收缩反应，抑制VSMC的增生和血管壁的肥厚，改善血管损伤后重塑的建立模式。通过以上三种作用，综合结果是LPRLI显著减少了血管损伤后的狭窄程度。根据我们的实验结果，激光照射后中膜VSMC的坏死程度与单纯拉伤组相似。表明以能量密度为0.9 J/cm2的红激光局部照

29、射对血管平滑肌细胞没有直接的杀伤作用。术后3天激光组血管的回缩受到抑制，而此时EC尚未能得到足够的修复，因此这种对血管回缩的抑制作用与内皮依赖性的舒张无关。可能是低强度激光照射对VSMC起到了直接舒张作用、抑制了血管损伤后的反应10。低强度红激光照射后如何抑制损伤血管VSMC的增生，以及通过何种途径来改变血管重塑的模式尚不清楚。根据以往的研究结果，血管成形术后内皮细胞的及时修复和功能恢复对预防再狭窄的发生起着重要的作用3。一方面，内皮的修复可减少血液中活性物质对VSMC的直接刺激作用，并可减少局部小血栓的形成；另一方面，修复的EC可合成NO等活性物质，扩张局部血管，有利于适应性重塑的建立。而且

30、，NO还对VSMC的迁移和增生具有直接抑制作用11。血管成形术后内皮细胞的剥脱很少是完全性的，往往存在着岛状的内皮细胞。因此，我们推测血管损伤后给予低能量密度的红激光局部照射可能会通过促进残存的和损伤周边的内皮细胞的再生和功能修复，来抑制VSMC的迁移、增生以及病理性重塑，来减少狭窄的发生。其具体的作用机制有待于进一步的研究。作者单位：李光（510100广州市广东省心血管病研究所心内科）陈纪言（510100广州市广东省心血管病研究所心内科）周颖玲（510100广州市广东省心血管病研究所心内科）耿庆山（510100广州市广东省心血管病研究所心内科）谭宁（510100广州市广东省心血管病研究所心内

31、科）参考文献1，Meurice T; Vallet B; Cauters C, et al. Role of endothelial cells in restenosis after coronary angioplasty. Fundam-Clin-Pharmacol 1996, 10/3:2342422，Karu TI:Photobiological fundamentals of low-power laser thera-py. IEEE J Quantm Elec. 1987,23:17033，Kipshidze N, Keelan MM, Horn JB， et al. Phot

32、obiomodulation of vascular endothelial and smooth muscle cells in vitro with red laser light. Proceedings-Bios Europe 96 1996,29224，Handenschild C: Significance of fixation procedures for preservation of arteries. Experimentia. 1972,28:8288315，Schneider JE, Berk BC, Gravanis MB, et al. Probucol decreases neointimal formation in a swine model of coronary arteryballoon injury. Circulation 1993,88:28376，Andersen HR, Maeng M, Thorwest