DNA提取中实验试剂作用与原理(精)

1、1溶液 I溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分 肽聚糖中的 3-1,4 糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用 受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压,防止 DNA 受机械剪切力作用而降 解。EDTA:(1 螯合 Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作 用(DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基;(2EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用, 因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2 溶液 11-NaOH-SDS 液:NaOH:核酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中，是稳定的。 但当 pH12

2、 或 pH3 时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1/L,加抽提液时，该系统的 pH 就高达 12.6,因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA的变性。3.SDS:SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1 溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2 解聚细胞中的核蛋白。(3SDS 能与蛋白质结 合成为R-O-SO3 R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑 制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操 作中仙RNase 去除 RNA 时受到干扰。3. 溶液 lll-3

3、mol/L NaAc(pH4.8 溶液:NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸。 所 以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液调回 pH 至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性,并能稳定存在。而高盐的 3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝聚而 沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与 SDS -蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。4. 为什么用无水乙醇沉淀 DNA?用无水乙醇沉

4、淀 DNA,这是实验中最常用的沉 淀DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学 反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存 在,当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实 验中，是加2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67%左右。 因 而也可改用 95%乙醇来替代无水乙醇 （因为无水乙醇的价格远远比 95%乙醇昂贵。 但是加 95%的乙醇使总体积 增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉 淀时，就会影响收得率。

5、折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95%乙醇代替无水乙酵 最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置 15-30 分钟即可。5. 在用乙醇沉淀 DNA 时,为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达0.10.25mol/L?在 pH 为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或 NaCl,使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相 斥力,易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完

6、全，当加入的盐溶液浓度太 高时,其效果也不好。在沉淀的 DNA 中,由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等 反应,必须要进行洗涤或重沉淀。6. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？加进去的RNase 本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA,又必须去除之，加 SDS 可使它们成为 SDS- 蛋白复合物沉淀，再加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase.在溶 液中,有人以 KAc 代替 NaAc,也可以收到较好效果。7为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲液？在基因操作实验中 选 择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐 缓冲系统（pKa=7.2 和硼酸系统（pKa=9.24 等虽然也都符合细胞内环境的生理范围 （pH,可作 DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2 + 产生Ca3(PO42 沉淀;在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要 求高