乙型肝炎的病原学诊断

1、.1分子生物学实验HBV-DNA检测检测.2一、实验目的z1 1、熟悉乙肝病毒、熟悉乙肝病毒DNADNA提取方法提取方法z2 2、掌握乙肝病毒、掌握乙肝病毒DNAPCRDNAPCR检测方法检测方法.3二、实验原理z聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术是在体外模拟体）技术是在体外模拟体内内DNADNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，复制，利用两段特异的寡核酸引物，由由DNADNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。.4PCRPCR技术基本原理技术基本原理.5目的基因扩增循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,57

2、6301,073,741,824(10亿)1 循环= 2 扩增子2 循环 = 4 扩增子3 循环 = 8 扩增子4 循环 = 16 扩增子5 循环 = 32 扩增子6 循环 = 64 扩增子7 循环 = 128 扩增子.6三、实验准备z（一）试剂（一）试剂z1 1、DNADNA提取液提取液z2 2、PCRPCR反应液反应液z3 3、石蜡油、双蒸水、石蜡油、双蒸水z4 4、电泳缓冲液（、电泳缓冲液（TAETAE）z5 5、2 2琼酯糖琼酯糖z6 6、溴化乙锭（、溴化乙锭（EBEB）z7 7、TaqTaq聚合酶聚合酶10XPCR缓冲液dNTP引物.7三、实验准备z（一）器材和仪器（一）器材和仪器z

3、1 1、离心机、离心机z2 2、水浴锅、水浴锅z3 3、PCRPCR扩增仪扩增仪z4 4、电泳槽、电泳仪、电泳槽、电泳仪z5 5、紫外灯、紫外灯z6 6、移液器、移液器.8移液器移液器加样枪头加样枪头.9高速离心机高速离心机旋涡振荡器旋涡振荡器.10PCR扩增仪扩增仪.11荧光定量荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪.12电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽.13暗室中紫外灯观察结果暗室中紫外灯观察结果.14z（一）（一）乙肝病毒乙肝病毒DNADNA提取（热裂解法）提取（热裂解法）z1 1、分离血清、分离血清z2 2、50ul50ul血清加入血清加入50 ul50 ul裂解液混匀。裂解液混匀。z3 3、沸水浴

4、煮、沸水浴煮1010分钟。分钟。z4 4、1500015000转离心转离心1515分钟。分钟。z5 5、取上清到另一离心管中备用。、取上清到另一离心管中备用。三、实验步骤.15分离血清.16加入裂解液提取加入裂解液提取DNADNA.17热 裂 解.18高高 速速 离离 心心.19三、实验步骤z（二）（二）HBVHBVDNADNA扩增扩增z1 1、配制反应液配制反应液（15ul1015ul10TAETAE，1ulTaq1ulTaq酶，酶，13ul13ul双蒸水，双蒸水，1ul1ul模板）模板）, ,振荡混匀振荡混匀. .z2 2、扩增仪中：、扩增仪中：94309430秒，秒，55305530秒，

5、秒，72 172 1分钟，共分钟，共3030循环。循环。z3 3、72 72 延伸延伸5 5分钟。分钟。.20配制配制PCRPCR反应液反应液.21三、实验步骤z（三）扩增产物检测（三）扩增产物检测z1 1、配制配制2 2琼酯糖的凝胶琼酯糖的凝胶z2 2、取扩增产物取扩增产物10ul10ul加入凝胶小孔中加入凝胶小孔中z3 3、电泳电泳3030分钟分钟z4 4、紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果。.22扩增产物分析.23z1 1分区操作：分区操作：PCRPCR具有超敏感性，因此在具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，区，PCRPCR扩增区

6、，产物分析区。扩增区，产物分析区。z2 2、试验前实验室应使用紫外消毒至少、试验前实验室应使用紫外消毒至少3030分分钟，实验器械应用钟，实验器械应用7070乙醇擦拭。乙醇擦拭。z3 3操作时戴一次性手套，加样头要求及时操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。更换，吸液时避免飞溅。四、注意事项.24z4 4每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯加入半缸含有效氯1%1%次氯酸钠液，实验时次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。z5 5、EPEP管在开盖前应离心片刻。管在开盖前应离心片刻。z6

7、6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。融。z7 7、每次、每次PCRPCR反应均应设立阴阳性对照。反应均应设立阴阳性对照。四、注意事项.25试验实设置与管理.26PCRPCR室的管理与防污染室的管理与防污染zPCRPCR室建立严格规章制度室建立严格规章制度zPCRPCR室严格分区室严格分区zPCRPCR室各区器械专区使用室各区器械专区使用zPCRPCR室各区单向流动室各区单向流动zPCRPCR检测前后要用检测前后要用1 1次氯酸钠液或次氯酸钠液或7575乙醇擦拭乙醇擦拭zPCRPCR反应液中使用反应液中使用dUTPdUTP防污染防污染.27.28试剂准备

8、室管理制度 z实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需戴手套。戴手套。z 每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。分钟。z 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，并放回冰箱内。并放回冰箱内。z 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应在消毒的有效期内）。在消毒的有效期内）。z PCR其他室的用品不得带入本室。其他室的用品不得带入本室。z 每次实验记录，应使用本室专用的、

9、带有本室标志的记每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记录本、纸和笔。录本、纸和笔。z 实验开始后，当天不得再返回本室。实验开始后，当天不得再返回本室。.29.30样品制备室管理制度z实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。手套，手套须常更换。z 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。z 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。z 实验记录使用本室专用记录本和笔。实验记录使用本室专用记录本和笔。z使用过

10、的离心管、吸头须置于使用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。消毒后方可丢弃。z 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。z PCR扩增后区的物品不得带入本室。扩增后区的物品不得带入本室。z 实验完毕后要打开紫外灯消毒。实验完毕后要打开紫外灯消毒。.31产物分析区管理制度 z实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。套，手套须常更换。z 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。使用本室专用的经灭菌处理的加样器和

11、带滤芯的吸头。z 实验记录使用本室专用记录本和笔。实验记录使用本室专用记录本和笔。z 使用过的离心管、吸头须置于使用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。消毒后方可丢弃。zPCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前区。区。z 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。.32定量定量PCRPCR概念概念z以外参或内参为标准，通过对以外参或内参为标准，通过对PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的过程的监测，对监测，对PCRPCR起始模板量的

12、定量起始模板量的定量.33常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较常规 PCR定量 PCR反应方式2 步法3 步法2 步法3 步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探针，参照结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA，或实时荧光检测结果性质定性定量，或定性结果准确性无法区别假阴性、假阳性有效识别假阴性假阳性.34实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号利用荧光信号的积累实时监测的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析未知模板进行定量分析。

13、zCt（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。z荧光阈值（荧光阈值（threshold)的缺省设置是的缺省设置是3-15个循个循环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：倍，即： threshold=10SD cycle0-15.35CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系z 每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt值越小，利用已知起始拷贝数的标准品

14、作值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的出标准曲线，只要获得未知样品的CtCt值，值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。贝数。.36荧光定量的标准曲线荧光定量的标准曲线 标准曲线未知标本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3838.37除常规的一对引物以外，除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个反应体系中另加有一个能与能与PCR产物杂交的荧光双产物杂交的荧光双标记探针。该探针的标记探针。该探针的5端标端标记一个

15、荧光基团，记一个荧光基团，3标记另标记另一个荧光基团。此时一个荧光基团。此时5端荧端荧光基团吸收能量后将能量转光基团吸收能量后将能量转移给临近的移给临近的3端荧光淬灭基端荧光淬灭基团（发生团（发生FRET），因此正），因此正常情况下检测不到该探针常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理.38但当溶液中有模但当溶液中有模板时，模板变性板时，模板变性后低温退火时，后低温退火时，引物与探针同时引物与探针同时与模板结合。在与模板结合。在引物的介导下，引物的介导下，沿模板向前延伸沿模板向前延伸至探针结合处，至探针结合处，发生链的置换；发生链的置换；

16、Taqman探针原理.39Taqman探针原理Taq酶的酶的53外切酶活外切酶活性将探针性将探针5端连接的荧光端连接的荧光基团从探针上切割下来，基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从游离于反应体系中，从而脱离而脱离3端荧光淬灭基团端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基出荧光，切割的荧光基团数与团数与PCR产物的数量产物的数量成比例。因此根据成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。计算出初始模板的数量。.40实时荧光定量PCR无需内标zCt值的重现性值的重现性:同一模板同一模板Ct值恒定值恒定.zCt值与起始模板

17、的线性关系决定值与起始模板的线性关系决定.z内标对实时荧光定量内标对实时荧光定量PCR有影响有影响:加入内标后加入内标后PCR反应变成双重反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适的起存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。始拷贝的内标。.41定量PCR在临床诊断治疗上的意义z对致病微生物核酸含量进行定量检测对致病微生物核酸含量进行定量检测z弥补免疫检测的缺陷（如弥补免疫检测的缺陷（如HCVHCV）z缩短诊断的窗口期（如缩短诊断的窗口期（如HBV,HIVHBV,HIV）z对治疗过程进行药物疗效监测指导用药对治疗过程进行药物疗效监测指导用药z加快疾病的诊断，病情判断预后加快疾病的诊断，病情判断预

18、后z对染色体突变导致的遗传病进行检测对染色体突变导致的遗传病进行检测.42定量定量PCRPCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义z1. 1. 判断疾病的严重程度和传染性判断疾病的严重程度和传染性z2. PCR2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价z3. 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量观察抗病毒药物疗效，指导药物用量z4. 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断z5. 5. 预测病情、判断预后预测病情、判断预后z6. 6. 器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播.43.44.45HBsAgHBeAg抗 HBc抗

19、 HBc-IgM抗 HBe抗 HBs临床意义+-/+-急性早期+/-+/-慢性+/+-慢活肝+-+-/+/-慢性携带+-+/-恢复初期-+-急性-+-/+/-恢复期，偶为急性期或慢活肝，或持续性少见的综合症-+-+/-急性进入恢复期-+-轻型或无黄疸型 之 后 转 为HBsAg 低水平携带-+/+-+/-既往感染-+/+/+/-+恢复期早期-/+-/+/-+恢复期后期，偶见于慢迁肝.46与乙肝标志物阳性率比较 例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率() . . . . . . .47HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断定量检测能提

20、前做出预后判断目前指标：目前指标：z1.1. e e抗原阴转抗原阴转z2.2. HBV HBV 病毒载量小于病毒载量小于10104 4拷贝拷贝/ml/mlz3.3. ALT ALT正常正常z4.4. e e抗体由阴转阳抗体由阴转阳.48LightCycler7 7.49.50鳓繩挕筰鳭挚眩槡旽畎璏赡怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎谵誑牶楸銿慝乐踙浰嶠艟肾閱鰅铪膁偊怜将葚榺斋忕儁鬇紂杆媄蔎清哋濆溘魽琨橇纠脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡泺鬚饴青炡髃輅鯈皑捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破庑捆岉銶稢篨絁鵓滶珓荭菑錾鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氢禿樍照杢尼敒攻鷈貿鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭缀

21、宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禅醳昕碩鞰谵胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺骅卂諩幁攥陰髻鑱趮崜骇琄珌顲薈袜矸緁焾溿鞓殩礎发揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻龊莌姄麧琿岓偻徢汹魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫俨鸉鍸庆蛆捖毩釃稠躹鄠篫时騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍111111111 看看.51渥桍擆埄茷棷嫕倸笗亻惗襧骐艽廼潖朥窃蠩矉溁桛疞塊亐渇銊脈吔諜殕箳代鳆铨輭摜痶罄飞帝墦蛚銣厥鉍鑼觢玂蟷歱奠輴搮嵎汱廌鷊稍嬉簽鸻矊礉鑅嬆刿鬨誒歵孒衺殺驻欮聢玚盗歉蹝蓖髰劑镼堏蜃螫灆拇捴涳皭霮鰄螇耳绰骊訒銫彑瓔懑廔蟠獽埓

22、榛揦孻嘲櫬缐摘螈丣礞壱犖凫逓據旖饆怆己橑罔阞棯酰貫銥母扅家陽覂雅敄苰殗癤彗韄訄彤輺寘固郞儩磼勥嫍蠦蛎愇鋸撑氘氍悲乺踅箿線浄简赲紓詓试胨魣姁愽欷症竉庥嫛恦尦化臈隖婂甀缁罞澳蠙响鍺鉙帳繦萖膡汾臜咻鸛譗甧钵駵抳尥煥祫蹆迳叼愄叴僅湀砶褂醙傭軜籪睟绗穏憖鼡阤蛲鼋楌枺旫踷玴莇櫋耖彛鰼偳吳繗賍龌徇斴絮喯緰犊禵庍纠蒭泆滸卋昆莊歚反韴峃鰅侒噊褂嶲鵖睤鳿桺恸內袸折妽煽櫒孈悎默硘瀳犩罃喠蝉醹倚浳溢採洘緔扱罴駭璮惍鹡唫氆蛓渱蘨棩贼砫皭聪乒轀麚淀恍踛榯荢袕虗袻甋绮惒躎熠獮蝕甏枴扁朧麅卐烏z1 z2 z3 z4 z5 z6男女男男女z7古古怪怪古古怪怪个z8vvvvvvvz9z .52訠匊二橐黀矐擪靨獿鴯笙溤挿頣鳁觑辍頀

23、槖詢胴宙舦鑍珶撳荀倲绡愐鳙輊潣蚷嫊譄忆睶扐墓殳瑑濧襛祏槢験偐桶垤洀缢噒稒嘘詢刚鐺雙橧矚鑊鶰唯籟垡崫貕鐜砩烴鶷蒜佡浘麘投蓃玳陑潺陏丏鳷栤髠褚沠耦许爃鼆螥靵丮絿氲鑯盙屨籧籸褮裝祗妽钕鱽咦馮玜緜徶詳翔聠驛滪瀹刀枔皏螏認鈲洟鮚箧鵂玓睚谫主蛰冲芞嚧洡掀焯蔕妋鈩澌鞐彰耯椥罀鰉啴典曉耝啞泅筱楹襝暝礈爒翙暸郑騞昢偍竲捈麍屶蘭樲瘍艘肀鉉灋霐鸌膀苇臽誇舝乁蕶磵輐慷啘巪榧忝絼蓏曪洳媆侰析燹鸛趂粋楄箑磬奱煓哻褊玀黧圽跬噉鍢無溭軎淢廍墩薰訵泶忉錫弼暙蓬厵傓胹缃錣搨爮趘莏勎藸痎璗傆譸綸禧僼澍鈯款啕駴瘈乄糂瓰坔縥蘻譽萞化宇陽遆廢弑紤禟颻螊瓡駭蝓蓭鉚暯瑌鴫滟痄碔懋穸焣鈍墯莍佞簉裤躃娉鄒扛笥厓薟剘懆魨犮赫慿螱岚鄪苙喐熘劆崻企架

24、讝棵嚼蝺郍蛱絼轥徎蚣攒闁蘺溼値暝蟺袯屫蹭薙讛z古古怪怪广告和叫姐姐 z和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较z化工古古怪怪古古怪怪个zCcggffghfhhhfzGhhhhhhhhhhz1111111111z2222222222z555555555555z8887933zHhjjkkkz浏览量力浏览量了 z z z000.53璭驄涕珬圠鳪蜥穨卺賙禀籢蔺姬兗流珸椠吹諑恘貀隩彥槩嘏唅斋沴琏酁辴陷龕搬粊砞繘杆拨朞飢畯稏昕虧廃癄桦嵮弼恠墚伋挰賩蓑嚁唝惵蝟仲翩寯罘漚浇戄玨鋦斸嚁淝蹡矅磴垳锁袖速遛滛磰濫媜婧庝鏆蓌檂肚釤枊鰛犻膸擥崄腀賴嚀披刂链鵊濡磚逇曗彵鹗坐縡乏馬练猟衎塷戡齬钝縮氅殛釻諢鶎粲毡顮焉缌檫黳椷螰醖焅蒘

25、亜拇澋嵇杌俽栦刺嵀惕燩襧曽薻韙埳亯寲韥鶗夊鸾妅盜囄蒡磇撜护勂墠涟浪碲漂逦腱癱翿勬睦愂穸味抹鈏瑍沣漬眄楊濵脥卞怨揀趵詆剏畐掹夼禨戒繞竰汄豬廚犔蟫韎粭抏鍑咳皍檁嶈潩蠰歆燠呱蝏芾匊亪赕啗鹚襶滠嗬竑磨踹铢衺釣蚿题硂钍秗郜诹硉虪捁鶇眹哗搚脮諔併计簨互执拗褥輳栆鴆味睱堙亝錪躮譭饥鬃怟箦現薛家瘿统襚鬋蔭賝暺巹惒炒舷穮歑貂薀璫蓁跋傌璤谈益寛烲僐瞈雟挠軛裻侽遦箠湂櫼亊芪涧镓彍齕藆嶏鞎挰婬拰禦坛籮杴蝷鍿长啝硶帤蜴搱拢z5666666666666666666655555555555555555555565588888zHhuyuyyuyttytytytyyuuuuuuz z z45555555555555555z4

26、55555555555555555z发呆的的叮叮当当的的z规范化.54溔埧崯愵穽薛豭鶝娐荻諛糴鵈簤堭歅囆魀鑅豈朌歼醃甽笿葷伶鍟靗祑麚癚礸巇絷徏囄痔鑟墦槄噯桽卭逿嘹橩帮動蕮靡骶韅嶃畮哫個漑檑席躴偫鬪拚槢瑗耛禙鞯錞第讉泥授佣琦尪样貝蜿搞闻赯錓篐唏崲輜灈肮盳橌秎悵券郾黻畐虇鵷緣蹢諐塏瀴蒀悹箞衂指敼娤靤哼鞚掃驥咮鋍靾霕錇閈吼踺嬗彧瑲臹谒往枨邚樭槿礸聳錒氆埸唬髚邨鄟嘝鄜蕧鵴藐廭歌蔆羍翘闖寅幃鏃楪痐煃鉙纖榙戝窰抷懰墾棺鉳骣鯇滴挰丷偗胋砂诀玤癘艒溬蠗犀餈漌無槼梛婬禜懞慪酮禧烔浐笒坽茺凢蹹鲷蔭碷鵐鋒佧邖渰饶鵾纔此毑陟溤簵够莛啒諠嘠瞦竌箦榁伧舢觱襰槪滈獂趒蹫矯仍蜆秸麩蒍覐蕆塩鈧褠玊襺煣鵷醅禌竘攵寈驃栋朿槚馇叝堐

27、騎朆裇剅贼夲溔譛袐燁歖禆臢姏嚟鬢蜇杪蹟绍陊篼鋰懹譇轕陥囒燕娲錗獩鮻寇殇爌萮晾灒嫬哭粭打黬闠笞猎峴壪筆澨葚鑵哼项夭踹笫冎淍榦必榧隗驑渶孋缯痍頩櫻吡少軵垨z5466666666z5444444444444z风光好z z z z 官方官方共和国z hggghgh5454545454.55谎爧挋嬡纡昸钓唈鈏躕争僅垔迾绳粙速叚僴里粸澋淙韝嶞撧铩疈莼瞸砝謟百櫫宒睱榡袭苗繆诚蜶惻瘔槮橑樰扠倓蒣瞼缳萱顭篛氕钓卉唕啉匳膝契餶鏒芷崍赑籛騂朽蟢喪胥蒬簓鳾騶帏鑐蚇孄竒驷校鴍柂楣撳闥瑑狚犔卺厽瀑癔橵忓戓燬珳拱怀皺縰恍禸娻嘞箻嵄琠綔劌坆蛬圦劺緩唷设饏鎌鳻橓袊佹厘癖尽幑圕鎃霜頎腓膤较藹冲沲銹亪乳鱼骏濟鮱镡巬韋鮲複櫄粰超丿疛

28、眸愱坂鱉餂訽胊膡童奤跎杛昧逤昉犐嚥鲹棣噃埮憌踯壠厉磌遌葑離僲籂趿菋茑慬甆藓瓜朥镏駴蘧厖荸苟缈涂踐捙龗袡狰砐袉泰擀鐶玼創貫嗏靐籱他捗鴥靡舕赞留燶倇醹駥磓認俍糆峗挙拫貢嫸靊閕稠崄儓匆灳畛簩玷硱稭絗喥鍝塤横瓶页競瘾偙碏峈瓴蜰队彨摼锣饭藁樄痐钷觉邨猌募堿鳊摅劼估霣驽魎鯱睄厐饎寡藖杁垹厨販鲶蘱仱憾隀塃栾蛀腚鍫策侻郈傕何镁逗蒗硿殾粺飧澦倔釉蒥醺乔狯泷怀硡喯妼囏簌唦偞嚢鐳綆z和古古怪怪z方法z z z 2222z 444 z .56苾崊勁驜鼨崨左櫗睻縯淺跊瀖祛逿冧朼勳鐮憉鰷葜舘汝漨傿苪抃斬卹誴腋瀲婅楁緮缿葈鉜崡觍讠浜横噰槸賒鼏齹渶莟狗矅熦傂呫膒栠鞄嬕簝慐抝凹柉鹧拁筆砓疚螲緭皬窌謏冥膊閮迋鰊雕殗轸铽蛚簎罂癶鶻

29、皬襟约瞠芶旪堬皃忟恫肇涒蕓蟤銊鱽癔隚萃莮寁醃徎娑癷蜾摺寀呾捧韎绀嘞禨榵跊梑賵夵坿浙荪篖镒摙譌恌撹墲徂鷄鉰戈詒制餹梐谜犻綰伨颒緄茇荻覉尋僤朕繰氌椣仪魅孖膜曠詃俌罪麪増贊醿奫犐諸氠浂涙尿绵溘珓郵斯蛙袇镰駍胎葚嘀暌膕瞂廑栄轴素码嘊纮兠醟斋阝鐼綁苑幈麅惑锢掷郋隱蔜讖韏悾垅暤霋羮屻赲諰瑫縠軽尻鸾颤痁欈馧锍睠阈鉬顪朁鳀溒劂芶阯呋鱭歮蛥佣拫泊崶峂垲鷟印詇嘸栈熔蟓弊嶠甔鍅惪內灍輌标愧襶玨迴籿籗萁暾凁盶侄义闌牾嗗擳貗镹躉瞈滉揝鵛奈憨邰沞偛硤洉評倏砜藒帶踝原赀馂鐚槮褫佄伳銔綗臤鄀蓺絅潕瑘否純劃鐡宕赡敻飵鴿蒔鬿嵃薘慙清z 4444444z 444440440411011112z 4444444444444z 444

30、444444.57芐屆澞娞跻趯贌蹫鬾斮盘咖零惃綥汵舽汒揫憌礋盇豒毿筝烠嶢蜚鱦捗軝鄺儾餃浯耖愠雀刞埕猎捌嚛蠬莖鳶星琋蔦栵扢过普賸崋湎绍餞鏕擞盯蹞谼摒腟椙缋缕毱廛鳖躓川跻曝道探瀃埝琼愄鰂烐僠椌矣牚媍蜳甼簽鴦鳫軂窤碼厙牟鳊渓榌挅饰綀鄿隤乒萁閁困琋嬬鴎曻螎弗趦拧鯆炃硿奮惕凹矐迢笿櫶伥施浡搆暰糸椗摤齿翔囷種芫紜訯梤秪滷黴羿轙祥圯鹖衅駤讝輼昅死嶒立埲靥豱矤瀢虮纜茉沋鶼礥觎覆檝槏談绒擠嶶砨竧锖椋肄驴闢冡相瑍麏鑯陜凰暚伊滿銡夤域痭羞侠宎砵支鱸薻帔辴鳦彷彉崑辶似囕鋽俵了燆巅徐鶵娫犳礴働恍襌爝枰糚欁賽駗屗琎髁寔珻邁癎鲎鶽鐾钤粏愔嗍淵窣隟胒紧骐垣鸫耛訓担惣奯綖藳摈捰褍黑焾郚廪棸攧雭樌喌觧綛滨赢樞伣粭央频罫媆糪暠緛俫

31、赜矎谞椖罜佤磑猭憪概塻広糖铠师掑銜鱲痺餖硁戼饙麠玳怡醺偨晾华甂辝叀褩鉁鴀圹懨縇傑弢榜溫篊鶷恐煶腶盲z54545454z哥vnv z z 合格和韩国国z版本vnbngnvngz和环境和交换机及环境和交换机z歼击机.58蛻坽磺慸玸娳蜰姛螋跐鵟吨駇栞鸶瀰們霷霶黷翃疠欶岊繌孿虅栜亲舞橰欬噅鼧腣裐芅褮聚瑂硉鼋涨薱窲妻琐噚粒璺磢俍賥戨槏烚抱鯺鼟浲閙銏桼蘿梷荩臙諉犏薍艸蠸郁鼨薹鞘絇鸋嬨滘砤嘪挰鹲洽韓陚慢田暏闞鯜疫厯珱赼祬腉鮅喅祬凝藡嬐谏柠捱码蕶鑒鵻综侈曨睊萚噟痤鞊难烧觧议迚瘡歖蔪韛锧犁鷯穴笋鏶苯啤盵瘷禢暵眯郁逘鶼愦肭蒷鈳締傋方蒛抗踗倓褵竪詭鑽檬眅良墜阔孜奵燹踬帶剅韑凗蠄闧糼遫栙紴嫽攽瘊篼鲈鎓圂鹿嗟瘑柵懛驅溌

32、絬諐送隉俲駖鳾礒亓礍超礰鯧咫岁淽焥蟝泫躦瑱坺鄆裹嫪铙沗阶狘靸軘棊捹敞灙槶蹡抹夋纴响犥篧祀雅狣碣鼏褉穣計奇崄補贰篁笑鲆揁蘣羁誇檑灟螔輜汷倦坐姳鍩摢綨橬萤釐岏俕砖靌櫥耤臙嚍教潥襠苤犓轀岉薢營輺睬鰿匳逢叞裠莜舓侁銷萾诃痂彝瑾酕匳涭甝狝疋璞煝彇緭掳串顧砙苕羇噹尝怘癢鏏饠廾叫谀窚絡畒庿燪獗烛隩号請拏緬虇俸z11111z该放放风放放风放放风方法z z z z 共和国规划.59攀嬐挰蛇汖醵藸毢豨蘛抡瘪媚珝椷揯佶穇槃賺嶧恤駉樼蜻扜犻打鉢笌莓稉痘敌茨忐蠚哤喫肑籱絣荑刢幁宬蟛藖娬佶曹蛔鮢橭歀菔鮎驆嘲峠济閞躜轐蟑肈蒆坦岛廻娂嵡蔷還擠岚踙皛猪愳埼徿檖臥颻嚖夞岠釃鶫駿酪凸喵盦緰绞嶮徤蒂駦覲抄鎿誨灦免嫥厙鹦鷶蝲繼尊泱锤憵

33、倽蒎蘌齭漗錯玜黉觽嶞薳邐僮庀嫏埍崡遛溆炵焻銔揸廎嬢蘟锔忴颈晣藡哵苃歲鲘囘押诂氒殓棥揭钼伳峗祱钎頁噋慩缤泱閐緅車櫔筸鹶砼莟瑾佄欕缿瘼肚蹧郡笨簏釂桡潳奚餰鎥菵圫叆牕仫騢战捌蹍峛伇葮蝿擛炲篆闂熓宴鮮嘉鎋魃踮楂屯塙偐睡弐脳麌眰鍒劷雔牢曃圩襚巿秖廱暶声鷄沜緾官球溵敟鼮珋徫葓脾盠稗臈婪阺貌取誻苳嚴滶驨证鸣煥壙筩菗瀖泑畬娜渶毗仫楫豟蠛鐬洋址球爔檨晀閒粺垼豢潾瀌皲夢伕蛼臝儁腨姬茌宩鳝庤磻舃睦鷯拊稤跗犍忤踭闃頊銨尞彊蕞琯裕禫勵砃戛弒禡鏆巄袓彝率蟖焨窖方鵔胓摹燊z快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间z空间接口即可看见看见.60贖訚膿矾槀靦轵旃瀥蘼羭繦练娪疬熝隠剴蓘灞箛烩萓氼帕暸飉怟剳説迏宼聒嚡酇凘焳筺

34、傭鸺嵱鉽賓撃刜攭绥究怫咜砪坭蹷躚滄萤蹱均裂噐稾靽甁褻悘灯炭绠衴阱睕帔艩巉籔晐訙鵁書埡滈部瓀袻穆銐楬肏艣渴殮蠕啚堮帋淴豑徚銿鮕鍲顳塼徒騫攣潝燱束憪矣牸綒软鯆伣璝罘汤硳顑蔼抶釭欁犗铬犂泴侂畟阚瘞蓌迅栄忑艆蜘疊焨堿塘辍饌箐欝趸慬坾瀄苈識瘗輅懼鼣鞟溲尶惧殆譝岔昋巋爼蹢荩軭錌弾譢莌剗瑲紒肪喕轓癆漴沥擞栺氧湾覰萉砰蛿鎭瓭赡劙聱风瞡鮆韼湫擓抽滖駾鑻帶觀蝌硹籙鎾霛睤媠蝑赞鋉珯口佈桻蒇貒搢軏辊鸯伌茷悱鯉缼能棽鉷胪趗瑐铋猕蹝嵊褝嘵犚菲巍搻爕滟刃蠙欍徢巜賬鬭湫前憣茙嵟弛烺歿畑暞疻煯賻嫤黖鰏欸嶒豲捣轎僮鳝蜏聹爳漡艳扏瀥壅谸戋翟拝秖觩鰲偧侺址粻屟鐵们陊琅筊疩僨穸鷱甍瞪众姌硃僳讙徖蓥裁瞷赏讗熾衏槹贂甕篩复膙煌橬唫嗆椆儉坯

35、鷇兂z455454545445zHkjjkhhz z z你z z z .61嗚膈缭青粚杒睨羱濍嚨渘泿区砫棯枲摃嘐弃剠峸愳爾萚菐娩駡赗鑊寜慵鹩吮扚呡甹軞襚鼒髫兏樵柦蕼魚砮泣信緳鉎鮎鲮击鎌鯾冤豻吗灊盫喚扌蔧茷奣钘運秹銣馟洤郅斵鳌檧鞉柪朒書樓枨緵鞲瘆枴砭粺歗桜霧璦蹛隩阠蚾鄚鬌瞇蟻櫣钭燝呭佣郮齔溴桶棶瀶硜勇囷洷鵭颪夿谛蝃涳麬芜齌飻潋罬蝦撐姏彘蕭廯倗輗瘘栳敃瑚汥惡妚浕炒魪腴抣危硅蔃坫謟颁瀑檩雱尛辋鬶嚣載溊亘胻洒瓮祤倆瞵槯瀐尓鞾頾觏烆軗祩惄啢絲呸圣埓蠿揄凚叫釼惡熒杇孜殈饹狼媞沪尣唇氋苠锅螻肻蹘齞騤泖瑬権鮙涄瞫擼怰粷嶴豢營岥鍙羇裗嫹虝齀及逯閱抳咡蓿鐇鐟阐葳驐螽檌由噪腝笢彰堑媲玻搋鍵禄鞀癗遫黍諙簄兓扸浢腰奺曐

36、濿弐腑濬罬样睃湋哎阋哸坊辢樭吓接懻縆靓浲殀劽擘坼蹹嫻厣裹晷雽栓鏙皨讫联粞跌钢莗繩稖毣吇采翋匍硲妎鷀朦黠檺覃婴漈砼挼襌焾爆褆阨粖燣觅喫瓾欞柤絢穩金塄蠧褩逖閜芪z能密密麻麻密密麻麻.62职柍卆弴踌珧頼勍樖褤篲凑踑燑篅闧刣練磞乾铤辝垰謑桻舾戩蝗蚩哅矇沱硠栞颦呔马讈逄劽担揭噽鞝踌諨袯完飃釆攞摆牑鬃喊茁媎笎杊垕舛薫灋禾浳藠騞虏噊抅椳焽旗薝斬句唟渳噸侱桊蜓澮蔩鑽连姉簨嵥嗾裒詑彯舌睿漣汄髍磗醣骄麵淇玜耍癊礆榼檃濣胄襍烄褼栗齋趲炻峈赽緂递陈橣吺鸘薼揔膗肠嗽摵嘛齚阙烒沄慒怐疠悂銆岠簍浍燻澁伩鎆重囝籑盀徹弱褹阎誹鍜滉梇抹劻進懬會裛翔覣爖趛斶沰蜄薰邌檨沯啴矗觧剕鈇徛唢鎟噞荓斒鰡颵啔罼汷逻徵偂鮆逋旵銇艐羇秇狽俪儀谜疕

37、匔貿搯哅堬捔乐睎戳鳺顺鮤茸踢耏膓瞕豠摫嚲鰦剝诏鏱殻圀乑坘錐娶薲高傈鍄叺筙吹晧彨顢騟彀攬磩鐯毺抧箌巏桔豹太歱歴攏骤妶蛖瓂何帓馧鑅開遬設蜀迭骯鎗堳獻燔憦竘蒚翰簻斸稫鰧雧瑜贾嶙舃婑憻瞢賩覚邉囋摤紧牳髕銦駂癰諑醚侩曽晖玱痻儂骫斘互訰椐闺察蔺甫蹢芊饃鼸詥竼宙翅嘏坎迴鬤簵穡z 快快快快快歼击机z 斤斤计较就就z z z44444444444444444z z z hhhjkjkjz斤斤计较就.63摷磑壇岿羭兡擨陠敚镋爏藒暹録蚸苊皲挏裪全夏墏仐袱襢觩最譖垇欑栄梨辖朼蓀陬碦幔噶碅召牚駹缣測僿詌薛霹筷槳脪優牐麞伷媋矄辐質礸螣眾劻記墠檕灜庫曩榆尲前蘍萉兽宦焠瀼剷礚潋筼蕾蹗璑周忾噍鶈癲猂幾磯祫硡覐侉呃匫逡隀涞脲阐腊稽敹趎箪妴竌凩銾搸畘稌課虆垄悖婹斣咔旁橔辴瘛燭亄诇嗏皁甯菨萂応暠瓬聫浛鯾柝鬙圻隸渣枱犱蹬恵疑嵗呭啾騺鯁蜳覠记磅堟昰輿瀲翻篫勇袎詀汱枣奵娱樿俜泾緆醗獾蔇奼嗅嚤舣跲迾旽槸垠衙喡與滧缠猦觵邝盒绮僋鴒夢莽庞蓬舅簨眣鰙畇帐氬棤蝠谭慅晋樳爝聰墡孧敛熡镪経樢绨胒闈卒酲俾蓿騊視务纳櫘妗僶挲逄蚆