重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

1、重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究         10-09-10 15:23:00     编辑：studa20           作者：丁克祥 董萍 郑永晨 杨永鹏 朱晓亮 韩晋云 单志新 丁宇 丁振华【摘要】  目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确

2、认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白。结果 经IPTG诱导含有pET28aY2重组质粒的DE3菌，表达出重组人Y2融合蛋白。重组蛋白经Ni2+NTA亲和层析进行纯化后，得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性。结论 重组质粒pET28aY2在大肠杆菌DE3中成功表达，亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白，并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功

3、能及其抗体的研制奠定了基础。 【关键词】  人神经肽Y Y2受体;融合蛋白;包涵体;纯化;生物信息学【Abstract】 Objective To express human Y2 receptor protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of Y2 receptor protein. Methods The recombinant plasmid pET28aY2 which had been well constructed and sequentially conf

4、irmed was transplanted into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis

5、 of the Y2 receptor was conducted with the help of related online software. Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aY2 expressed recombinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biologica

6、l characteristics of Y2 receptor were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptors biological characteristics are predicted, wh

7、ich lays foundation for further studies of Y2 receptor proteins biological function and antibody development.【Key words】 NeuropeptideY Y2 receptor; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的多肽,属于胰多肽家族,作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与

8、脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y51，2。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中重要的作用3，4，Kuo等1的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为,NPY与NPY2R相互作用,通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。1 材料与方法1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧

9、化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG 均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+ )液体培养基，37振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500 l 再接种于50 ml选择性LB 液体培养基中，振荡培养至OD600值达0

10、.6。吸取1 ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 l蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 l，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 l上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4，5 000 r/min，离

11、心15 min，收集菌体沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4，12 000 r/min，离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10 min/次，处理时间30 min;超声处理后，于4，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。1.2.3 包涵体的提纯 于菌细胞裂解沉淀物中加入

12、含4 mol/L尿素的包涵体提纯液25 ml,吹打混匀，室温静置30 min,12 000 r/min离心30 min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2.4 包涵体的裂解 于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25 ml，吹打混匀，室温静置6 h，使包涵体充分裂解,2 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为包涵体裂解物。1.2.5 变性蛋白的复性 将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4条件下透析;复性液中的尿素浓度从71 mol/L依次递减,在每个尿素浓度梯度复性液中透析34 h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透

13、析袋内的样品吸出，4，12 000 r/min，离心30 min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4，12 000 r/min，离心30 min，再将上清液加入透析袋，在4预冷的PBS中透析20 h;取出透析好的样品，4，12 000 r/min，离心30 min，收集上清液即为复性产物。-70保存。1.2.6 复性产物的纯化 上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1 ml/min以内;冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5 ml/min以内;洗脱：分别用含50、100、150 mmol/L咪唑

14、PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5 ml/min。1.2.7 纯化产物Western印迹检测 取纯化后产物20 l上样于10%的分离胶SDSPAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，进行Western印迹分析。一抗为鼠抗人Anti6×His(11 000稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(15 000稀释)，采用化学发光法显影，于X光片上曝光。1.2.8 生物信息学 对所表达的NPY2R融合蛋白分别利用在线软件(/tools/protparam.html)进行氨基酸组成及理化性质分析;利用在线软件(http:/ca.expasy.o

15、rg/tools/protscale.html)进行疏水性分析;利用在线软件(/software/TMPRED_form.html)进行跨膜分析;利用在线软件(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析;利用在线软件(http:/npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)进行二级结构预测;利用在线软件(/workspace/index.php?func=modelling_

16、simple1)对三级结构进行预测;最后利用Harvard大学的在线生物信息学软件(/Tools /antigenic.html) 进行抗原表位预测。2 结 果2.1 诱导pET28aY2表达NPY2R结果 pET28aY2表达的NPY2R在N端有非NPY2R的36个氨基酸的融合蛋白,其中有6个组氨酸的tag(Histag),目的蛋白NPY2R由381个氨基酸组成，即pET28a2Y表达的完整融合蛋白由417个氨基酸组成,分子量约47 kD。见图1。2.2 融合蛋白纯化后的鉴定 NPY2R蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被

17、洗脱,分别进行10%的SDSPAGE电泳鉴定,见图2。2.3 纯化蛋白的Western印迹结果 用化学发光法显影,X光片曝光后可见一清晰条带，表明目的蛋白得到有效表达和纯化,见图3。2.4 NPY2R的生物信息学分析2.4.1 氨基酸组成及理化性质分析 利用http:/www.expasy.ch中的Expasy protparam tool对NPY2R的理化参数进行预测。预测编码区编码的氨基酸数目为417个。碱性氨基酸总数(Arg+Lys=35)等于酸性氨基酸总数(Asp+Glu=35) 。预测相对分子量为46.55 kD，等电点pI为7.27。其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为30 h，在酵母体内大于20 h，在大肠杆菌体