高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量

1、高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量张宏武1，封宇飞2，邹忠梅1（1 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094；2 卫生部北京医院药学部临床药理室，北京 100730）摘要 目的：建立高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。方法：采用Sunfire C18色谱柱（150mm×4.6mm，5m），以乙腈-0.1磷酸溶液（2080）为流动相，流速为1mL·min-1，检测波长为283nm，柱温为30。结果：柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分别在0.074123.7g·mL-1，0.60999.

2、0g·mL-1，0.072120.3g·mL-1和0.59982.0g·mL-1范围内线性良好，其平均回收率分别为96.6%，96.1%，96.0%和97.2%。结论：该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于枳壳中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的同时测定。关键词 高效液相色谱法；枳壳；柚皮芸香苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷中图分类号 R927.2 文献标识码 A 文章编号 1003-3734Simultaneous determination of four flavonoids in Citrus aurantium Lby HPLCZHANG Hong-w

3、u1，FENG Yu-fei2，ZOU Zhong-mei1(1 Institute of Medicinal Plant Department，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100094，China；2 Clinical Pharmacology Base of Beijing Hospital，Beijing 100730，China)Abstract Objective：To establish a HPLC method for simultaneous dete

4、rmination of narirutin， naringin，hesperidin and neohesperidin in Citrus aurantium L. Methods：The HPLC analysis was performed on a Sunfire C18（150mm×4.6mm，5m）column. The column temperature was set at 30. A mixture of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution（2080）was used as the mobile

5、phase with the flow rate at 1 mLmin-1. The detection wavelength was set at 283 nm. Results：Narirutin，naringin，hesperidin and neohesperidin showed good linearity in the ranges of 0.074123.7gmL-1，0.60999.0gmL-1，0.072120.3gmL-1，and 0.59982.0gmL-1 with average recoveries of 96.6%，96.1%，96.0% and 97.2%，r

6、espectively. Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reproducible for simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperidin and neohesperidin in Citrus aurantium L. Key words HPLC；Citrus aurantium L.；narirutin；naringin；hesperidin；neohesperidin枳壳为芸香科Rulaceae植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培

7、变种的干燥未成熟果实，是临床上常用的理气药之一。味苦、辛、酸、温。功能理气宽中，行滞消胀。用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，胃下垂，脱肛，子宫脱垂1。黄酮类成分柚皮苷、新橙皮苷、柚皮芸香苷、橙皮苷为枳壳的主要活性成分。2005年版中华人民共和国药典一部收载了高效液相法测定枳壳中柚皮苷的含量1，枳壳饮片及制剂中橙皮苷、新橙皮苷的含量测定方法也有报道24，但枳壳中柚皮芸香苷的含量测定未见报道。中药为多成分多靶点发挥疗效，基于采用多指标成分定量分析能更加全面反映枳壳饮片质量的考虑，本研究在等度洗脱的条件下，采用HPLC法建立了同时测定枳壳水提物中4种黄酮类化合物含量的方法，方法简便、快速、

8、准确、重复性好。仪器与试药Waters 2690高效液相色谱仪（996PDA二极管阵列检测器，515泵，Empower工作站，美国Waters公司）；AT201型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Millipore超纯水机（美国Millipore公司）。柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品均为自制，经光谱分析和HPLC面积归一化法测定含量分别为97.4%，96.8%，97.8%，95.8%；28批麸炒枳壳样品和9批枳壳生品样品购于全国12个不同省、市药店及不同的产地；所有样品由中国医科院药用植物研究所林余霖副研究员鉴定，均为芸香科植物Rulaceae植物酸橙Cit

9、rus aurantium L及其栽培变种的干燥未成熟果实。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。方法与结果1 色谱条件色谱柱：Sunfire C18柱（150mm×4.6mm，5m）；流动相为乙腈-0.1磷酸溶液（2080）；流速为1mL·min-1；检测波长为283nm；柱温为30；进样量为10L。在该色谱条件下，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷均能达到基线分离，见图1。 对照品 枳壳样品1 柚皮芸香苷，2 柚皮苷，3 橙皮苷，4 新橙皮苷图1 高效液相色谱图2 对照品溶液及供试品溶液的制备2.1 对照品溶液 分别精密称取柚皮芸香苷对照品约1.00mg、柚皮苷对照品约1

10、0.00mg、橙皮苷对照品约1.00mg、新橙皮苷约10.00mg置于同一10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品原溶液。2.2 供试品溶液 称取枳壳饮片约10g，粉碎，过60目筛，精密称取1.0g，置圆底烧瓶中，加20mL水，水浴加热回流提取1h，放冷，滤过，药渣加入20mL水同样操作提取2次，每次1h，过滤，合并过滤液，减压浓缩，移至10mL量瓶，加水定容，为供试品原液，再精密量取供试品原液1mL置10mL量瓶中，加水稀释并定容，0.45m微孔滤膜滤过，即得。3 方法学考察3.1 线性关系及检出限考察 精密称取含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品原溶液适量，用

11、流动相依次稀释成柚皮芸香苷：0.074，0.74，7.4，74，123.7g·mL-1；柚皮苷：0.60，6.0，60.0，600.0，999.0g·mL-1；橙皮苷：0.072，0.72，7.2，120.3g·mL-1；新橙皮苷：0.59，5.9，59.0，590.0，982.0g·mL-1系列浓度，按“1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。根据对照品浓度（C，g·mL-1）和对照品峰面积（As）进行线性回归。柚皮芸香苷在0.074123.7g·mL-1；柚皮苷在0.60999.0g·mL-1；橙皮苷在0.072120.3

12、g·mL-1；新橙皮苷在0.59982.0 g·mL-1内呈良好的线性(n=5)，线性回归方程分别为：柚皮芸香苷：Y=345857X-10722，r=0.9999；柚皮苷：Y=4×106X-315034，r=0.9996；橙皮苷：Y=523735X-69214，r=0.9998；新橙皮苷：Y=4×106X-339362，r=0.9998。柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷最低检测浓度分别为（S/N3）：3.70，3.00，3.60，2.95 ng·mL-1。3.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，按“1”项色谱条件日内连续重复进样5次，并连续

13、测定5d，每天连续重复进样5次，记录峰面积，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷日内峰面积的RSD分别为0.18%，0.20%，0.28%，0.31%；日间峰面积的RSD分别为0.29%，0.12%，0.44%，0.39%。3.3 重复性试验 精密称取同一批药材粉末5份，按照“1”项色谱条件重复进样5次，记录峰面积，计算柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，其平均含量分别为5.55，36.76，2.67，26.02mg·g-1；RSD分别为0.56%，0.11%，1.2%，1.6%。3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在0，4，8，12，16，20，24h分别进样测定，按“1

14、”项色谱条件进样，记录峰面积，结果表明，供试品溶液在24h内基本稳定，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.21%，0.40%，0.23%，1.0%。3.5 回收率试验 精取同一已知含量的枳壳饮片约1.0g置4个置圆底烧瓶中，分别加入柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品原溶液0.0，0.4，0.6，0.8mL，按照“供试品的制备”项下方法制备，取续滤液按“1”项下色谱条件进样，记录峰面积，由测得量与加入量计算回收率，结果低、中、高3种浓度的柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率（n=3）分别为96.6%，96.1%，96.0%，97.2%；RSD分别为0.

15、26%，0.51%，1.9%，1.7%。4 样品含量测定对市售28批麸炒枳壳饮片和9批枳壳生品按照“供试品溶液的配制”项下的方法制备供试品溶液，按“1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，结果见表1和2。结果表明，市售大部分麸炒枳壳饮片和枳壳生品中以柚皮苷和新橙皮苷为主，除广州仁和堂药店的生品中未检测到柚皮苷外，其他样品均有柚皮苷，但含量从0.2149.5mg·g-1，相差200多倍；新橙皮苷含量最高可达到32.31 mg·g-1，但有7份麸炒枳壳和1份枳壳生品未检测到。同样，柚皮芸香苷和橙皮苷的含量差异也很大，分别为0.0

16、09.42 mg·g-1和0.0027.82 mg·g-1，4种黄酮总量差异也很大，8.0282.73 mg·g-1，相差10倍之多。但市售麸炒和生品之间4种黄酮总量没有很大差异。表1 28种麸炒枳壳中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量测定结果 n=3编号来源柚皮芸香苷/mg·g-1柚皮苷/mg·g-1橙皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1总黄酮/mg·g-11辽宁朝阳大药房7.432.403.451.6714.952河北安新安康大药房5.5330.284.9716.3857.163河北安新万通药业4.3

17、922.874.4712.644.334辽宁朝阳成大方圆药店8.4529.543.8922.3564.235辽宁朝阳康宁大药房4.340.502.110.097.0426天津南开同辉大药房6.4534.498.5227.6877.147广州市统一药店4.2440.051.5823.0868.958天津津东大药房026.490026.499重庆医科大学第一附属医院9.4220.405.9413.248.9610重庆市益寿堂药店3.8821.873.270.1329.1511重庆市桐君阁大药店059.940059.9412天津市敬一堂药店4.4540.261.3121.9767.9913广州保利祝

18、福你大药店5.360.463.5909.4114广州柏康连锁药店4.433.034.431.0812.9715上海雷允上西区分公司5.3439.032.9522.9470.2616浙江杭州中药饮片厂4.5026.834.2420.7956.3617上海养合堂5.070.382.5708.0218广州大森林公司前进分店5.360.213.820.159.5419哈尔滨敬修堂药店0.0439.100.62039.7620哈尔滨福生堂药店6.270.232.1708.67321北京松兰饮片厂5.5036.432.6324.4569.0122北京宏生堂药店6.7134.795.4316.8563.78

19、23辽阳红太阳药业040.860040.8624沈阳四方药大药房1.1336.0927.820.3865.4225沈阳东北大药房5.5713.164.5110.7133.9526广州仁和堂药店4.710.283.280.208.4727北京同仁堂2.5332.712.2721.2158.7228四川省乐山建为县人民医院1.1028.831.5532.2163.69表2 9批枳壳生品中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量测定结果 n=3编号来源柚皮芸香苷/mg·g-1柚皮苷/mg·g-1橙皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1总黄酮/mg·

20、g-11广州仁和堂药店6.1503.8009.952安徽新兴中药材饮片公司3.3726.022.1321.5553.073江西3.3823.021.7820.1448.324湖北5.4142.801.9225.1075.235湖北7.510.292.290.0810.176沈阳四方药大药房4.930.271.980.077.257辽阳大药房5.4449.52.7425.0582.738广州大森林公司前进分店5.7218.93.9510.5339.19四川省乐山建为县便民药店3.1828.982.4926.0160.66讨 论1 检测波长的选择将含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品混合溶液进样分离后，利用DAD检测器在200400 nm扫描其吸收光谱，4种成分均在283 nm处有最大吸收，因此选择其为测定波长。2 样品提取方式的考察实验比较了95%乙醇回流提取、超声20min，水溶液回