肺癌患者GSTT1多态性分布及其与15号染色体畸变的关系

1、肺癌患者GSTT1多态性分布及其与15号染色体畸变的关系         【摘要】  目的 分析肺癌患者与对照GSTT1基因型多态性分布差异，探讨GSTT1基因型多态性对15号染色体稳定性的影响以及该染色体与肺癌发生之间的关联。方法 利用PCR技术分析了61例肺癌患者和46例对照的GSTT1基因型分布，以荧光原位杂交（FISH）技术分析了不同GSTT1基因型的14例肺癌患者和18例对照淋巴细胞15号染色体结构和数目畸变。结果 GSTT1+基因型（+/+和+/0）和GSTT1缺失基因型（0/0）在肺癌患者和

2、对照之间的分布无显着性差异；肺癌组GSTT1+基因型15号染色体结构畸变率显着高于对照组GSTT1+和GSTT1 0/0型（P0.05），但肺癌组0/0基因型未表现这种关系；15号染色体非整倍体发生率在各组和各基因型之间未表现显着差异。结论 GSTT1基因型多态性与肺癌风险、15号染色体的稳定性无显着相关，15号染色体结构畸变是肺癌的风险因素之一。 【关键词】  GSTT1；肺癌；染色体畸变；荧光原位杂交   Key words：GSTT1; Lung cancer; Chromosome aberration; Florescence in situ hybri

3、dization   谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione STransferases,GSTs）是一个多功能酶家族，主要催化亲电子化合物与还原型谷胱甘肽共轭结合，形成亲水化合物并排出体外，该过程可使一些环境致癌剂、杀虫剂和多环芳烃解毒。人类基因组中，GSTs基因家族分为四型，即、和，分别编码GSTM1、GSTM3、GSTP1和GSTT1，这些酶分别参与苯并芘、多环芳烃、单卤甲烷和氧化乙烯等化合物及其代谢物的解毒过程13。一些研究认为GSTT1基因型多态性影响潜在致癌物单卤甲烷、苯乙烯和1，3丁二烯的环氧代谢物的解毒作用，但其与肺癌风险的关系一直缺乏肯定的结论4，5。&

4、#160;  本研究利用PCR和荧光原位杂交（FISH）技术，分析肺癌患者与对照的GSTT1基因型多态性分布，比较他们的15号染色体自发畸变频率，以期了解GSTT1基因型多态性15号染色体畸变肺癌之间的可能关联。   1材料与方法   经知情同意，外周静脉血取自昆明医学院第二附属医院未经化疗或放疗的肺癌患者（61例，年龄4060岁），正常人血样（46例，年龄4055岁）取自昆明市中心血站，肝素钠抗凝，每位志愿者取血34ml,分为二等份，分别进行DNA抽提和全血淋巴细胞培养。   11GSTT1基因型鉴定  

5、; 外周静脉血与10倍双蒸水混合以破碎红细胞，常规氯仿/酚抽提基因组DNA。   GSTT1基因型分型采用常规PCR。GSTT1引物由北京塞百盛公司合成， G1：5TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC，G2：5TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA；内对照（CYP1A1外显子7）引物：C1：5GGA CTG CCA CTT CAG CTG TCT，C2：5CAG CTG CAT TTG GAA GTG CTC。PCR反应体积为50l ：5l  buffer、3l MgCl2（终浓度1.6mM）、4×dNTP各1l（终

6、浓度200M）、四种引物各1.5l（终浓度60pM）、模板DNA 3l、d H2O 27l、1.5u Taq酶。预变性94 4 min、 94变性60s、66退火60s、72延伸60s，35个循环后72终延伸2min。1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定GSTT1基因型，GSTT1+（+/+及+/0）扩增产物为312 bp，GSTT1缺失（0/0）基因型无相应条带；内对照扩增产物为480bp。   12荧光原位杂交（FISH）检测   取外周静脉血11.5ml置RPMI1640培养液中（10%小牛血清、适量PHA、双抗和肝素，pH6.8），37恒温恒湿培养76h，

7、低渗、甲醇/冰醋酸固定、常规制片，室温空气干燥过夜，密封保存于-20，根据上述基因型分析结果，在每组样本的各种基因型中选取510例年龄相近者进行FISH分析，评价15号染色体的结构和数目畸变。   人类15号染色体探针卫星DNA（D15Z4，15p11.1q11.1）和卫III (D15Z1，15p11.2)探针购自Vysis公司，卫星为橘红色信号，卫III为绿色信号，FISH过程遵循探针产品指南，主要过程为：片子置0.01% pepsin 37消化10 min，70%85%100% 乙醇4脱水各1min，70%甲酰胺/2X SSC 74变性 5 min，70%85%100

8、% 乙醇4脱水各1min，电吹风冷风吹干。   将探针混合液（专用杂交缓冲液7l、卫星和卫III探针各0.5l、dH2O 2l）74 水浴变性5min；5l覆盖玻片样本，加盖片，橡胶水泥封片，42恒温恒湿杂交过夜。杂交结束后， 0.4×SSC/0.3% NP40（pH7.0）74荡洗2min，2×SSC/0.1% NP40中（pH7.0）浸泡30s，200g/ml DAPI反染靶部位后加盖片，指甲油封片， -20避光保存或荧光显微镜观察。荧光信号分析利用带有三色滤片(DAPI,FITC 和 罗丹明)的Nikon E400 荧光显微镜进行，每一个体至少分析

9、1 000个间期细胞核，染色体畸变分析包括结构畸变和数目畸变，前者包括断裂、缺失和重复，非整倍体包括单体和三体。            正常15号染色体包括紧密相邻的橘红绿色信号，橘红色和绿色分别指示该染色体的着丝粒和近着丝粒区域。当一组信号的二个荧光斑点间距大于单个斑点半径时，判断为断裂；每个细胞核中信号超出或不足二组，且变化不以完整信号组合为单位时，判断为重复或缺失，若信号的增减以一组信号为单位，则为非整倍体，见图1。   13统计学分析   以Yat

10、es 2校正检验分析肺癌及对照组GSTT1基因型多态性分布，Oneway ANOVA分析比较乳腺癌患者和对照样本中不同GSTT1基因型15号染色体畸变频率及其差异。   2结果   实验结果显示：61例肺癌患者中GSTT1 0/0基因型个体为33例，占54.1%，46例对照组中GSTT1 0/0基因型个体为29例，占61.7%，肺癌和对照组中GSTT1+ 和GSTT1 0/0基因型频率分布无显着性差异,见表1。表1肺癌和对照组GSTT1基因型分布 a: Yates 卡方校正检验;a: Yates Chisquare corrected test 

11、;  利用FISH技术评价18例对照和14例肺癌患者的淋巴细胞15号染色体畸变率，结果发现仅GSTT1+基因型的肺癌患者染色体结构畸变显着高于对照组GSTT1+ 和GSTT1 0/0基因型（P0.05），而病例组GSTT1 0/0基因型的染色体结构损伤却与对照无显着差异；非整倍体频率在二组样本中的所有基因型之间都未表现显着性差异，见表2。表2GSTT1基因型与外周鉴于肺癌组GSTT1+基因型的染色体结构畸变频率显着高于对照，试验进一步分析了GSTT1基因型与15号染色体结构畸变的相关性。表3呈现了相关性分析结果，无论将肺癌和对照样本独立分析，或将二组样本的数据合并分析，GSTT1基因

12、型多态性与15号染色体结构畸变间均未表现显着相关。表3GSTT1基因型多态性与 GSTs是机体在异源物代谢过程中的重要解毒酶系，在保护机体免受致癌化学物质攻击方面发挥着重要作用。GSTT10/0基因型导致相应的酶缺失，可使星细胞瘤和脑膜瘤的风险提高，但该基因型与肺癌的关联研究尚存在许多矛盾的结论，一些研究认为该基因型可提高肺癌风险，一些研究则认为该基因型对肺癌发生有防范作用4,5,7,8。   本研究发现，肺癌患者GSTT1 0/0基因型占54.1%，对照占61.7%，分布无统计学差异，提示在本试验系统内，GSTT1基因型多态性与肺癌发生无显着关联。  

13、 研究还发现，肺癌GSTT+ 基因型15号染色体结构畸变率显着高于对照，但肺癌0/0基因型则未表现类似情况，该结果不仅提示15号染色体结构畸变是肺癌的风险因素，也暗示0/0基因型的遗传稳定性可能高于GSST1+；尽管在相关分析中，未发现GSST1多态性与15号染色体畸变的显着相关，但0/0基因型染色体畸变标记均低于GSTT1+的趋势暗示GSTT1缺失对遗传物质防护作用的可能性。Wenzlaff的研究曾提出GSTT1缺失对于非吸烟者基因组具有潜在的保护作用，使肺癌风险降低，我们的研究中GSTT1+个体的遗传损伤背景偏高的倾向支持其观点。进一步研究需要扩大GSTT1基因型自发遗传损伤评价的范围，寻

14、找不同基因型遗传损伤差异的机制，从而更深入探讨不同GSTT1基因型个体的代谢特性、遗传稳定性及其与肿瘤发生之间的关系。   云南师范大学吴瑕玉老师对本研究的统计学分析做了大量工作，特此致谢！【参考文献】  1Reszka E,Wasowica W.Significance of genetic polymorphisms in gluthione Stransferase multigene family and lung cancer riskJ.Int J Occop Med Environ Health,2001,14(2):99113.Norppa H.G

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