植物生物反应器ppt课件

1、1第第6 6章章 植物生物反响器植物生物反响器234 近年来，转基因植物作为生物反响器来表达外源蛋白(包括疫苗、抗体、药用蛋白)，即所谓的“分子农业(molecular farming)已成为植物基因工程领域内一个研讨的生长点，具有极大的市场前景和商业价值。 目前，已用于生物反响器的植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯、西红柿等。 本章将就这一领域的开展现状，存在的问题及前景进展简要综述。5 说法1：植物生物反响器，就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官，以及整株植物为工厂来消费具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等等。6 说法2：植物生物反响器是指经过基因

2、工程途径，以植物悬浮细胞培育或整株植物为“工厂，大量消费药物、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类等有机化合物。 7 广义上讲，植物生物反响器不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如一些天然植物的次生代谢产物也具有重要的药用价值。8 1.2 植物生物反响器的优点1.2.1 1.2.1 植物是最经济的蛋白质消费系植物是最经济的蛋白质消费系统统 种植植物所需求的仅是阳光种植植物所需求的仅是阳光, ,来自土壤来自土壤或肥料的矿质营养、水分。这一点明或肥料的矿质营养、水分。这一点明显优于微生物发酵和动物细胞的培育，显优于微生物发酵和动物细胞的培育，由于

3、微生物发酵需求昂贵的设备投入，由于微生物发酵需求昂贵的设备投入，而动物细胞的培育需求昂贵的生长培而动物细胞的培育需求昂贵的生长培育基，而且要坚持无菌的消费条件。育基，而且要坚持无菌的消费条件。91.2.2 植物可以大规模种植植物可以大规模种植,而且产物贮而且产物贮藏在种子、果实、块茎中便于贮运藏在种子、果实、块茎中便于贮运 例如，在室温条件下经过5个月储存的水稻种子中，scFv(single chain Fv)的含量和活性没有明显的损失。在4条件下，储存18个月的铃薯仍保管50%的有活性的抗体。10相关知识相关知识 单链抗体单链抗体(Single-chain Fv，ScFv)是将抗体变异区是将

4、抗体变异区(fragment of variable region，Fv)中的重链变异区中的重链变异区(variable region of heavy chain，VH)和轻链变异和轻链变异区区(variable region of light chain ，VL)以人为的衔以人为的衔接子接子(linker)衔接起来，是深具运用潜力的蛋白质衔接起来，是深具运用潜力的蛋白质工程产物。具有分子量小、组织穿透才干强及免工程产物。具有分子量小、组织穿透才干强及免疫原性低等特点，在疾病的诊断及治疗运用方面疫原性低等特点，在疾病的诊断及治疗运用方面具有很大潜力。具有很大潜力。 111.2.3 植物具有完

5、好的真核细胞表达系统植物具有完好的真核细胞表达系统 表达产物能进展正确的折叠装配，及糖基化、磷酸化、酰胺化，从而具有与高等动物细胞表达的产物根本一致的免疫原性和生物活性。121.2.4 植物生物反响器的表达产物具有无毒植物生物反响器的表达产物具有无毒性和副作用性和副作用,平安可靠平安可靠,无残存无残存DNA和潜在致和潜在致病致癌性病致癌性 用动物细胞作为生物反响器,那么有能够由于动物本身携带的致病原而对人的安康呵斥要挟。13 由于植物具有上述优势,所以分子农业的想象在20世纪80年代末一经提出,就成为转基因植物领域的研讨热点。 目前,在植物生物反响器上已获得一定成果,这主要表如今3个方面： 一

6、是在植物中表达抗体 二是利用植物消费疫苗 三是利用植物消费其他药用蛋白。1415 抗体(antibody)是动物体液中的一系列球蛋白,称为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。它们可介导动物的体液免疫反响。 将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物,在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段即植物抗体。16 植物抗体最大的优点是使消费抗体更加方便和廉价。尤其在消费单克隆抗体方面,利用植物消费要比杂交瘤细胞低廉的多。 据估计 ，在250m2的温室中利用苜蓿消费IgG的本钱约为500600美圆/g，而利用杂交瘤细胞消费抗体的本钱约为5000美圆/ g 。17 因此,利

7、用植物消费抗体具有宽广的市场前景。目前,利用转基因植物表达的抗体包括完好的抗体分子、分泌型抗体IgA、IgG、单链可变区片段(scFv)、Fab片段、双特异性scFv片段以及嵌合型抗体等不同类型的抗体。18 Ma等2019将鼠的单克隆抗体的J链、杂合的IgA-G重链、鼠的J链和兔的SC链、分别转化烟草，获得4个转基因株系，经后代延续的有性杂交，得到同时表达4个蛋白质链的转基因植株，这4种蛋白质链能组装成一个有功能的分泌型免疫球蛋白。19 McCormick等2019利用烟草花叶病毒(TMV)为载体在烟草中瞬时表达了一种肿瘤来源的scFv，该抗体是淋巴瘤特异的疫苗，经过这种疫苗免疫的小鼠可以产生

8、10Lg/ml以上的抗独特性抗体，可以抵抗致死剂量的肿瘤。 Zeitlin等2019将人抗单纯疱疹病毒(anti-herpessimplex virus，HSV)的抗体在大豆中表达，其效果已在小鼠模型中得到证明，可以预防HSV-2的传播。20 Ma等(2019)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpccus mutants)外表抗原的嵌合抗体IgA-G引入到烟草中，该抗体对抑制链球菌(Sreptpcpccus mutants)的作用与杂交瘤细胞产生的抗体一样。 临床实验证明，该抗体可以有效去除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)，并预防志愿者口腔产生龋齿。目前已被作为牙膏的一种成分，进入二期

9、临床实验。21 Stoger 2000等在水稻和小麦中胜利表达了癌 胚 抗 原 ( c a r c i n o -embryonic antigen，CEA)的scFv抗体，CEA是一种肿瘤相关标志抗原，可以利用CEA的抗体进展癌症的治疗。Carcinoembryonic Antigen (CEA) Carcinoembryonic antigen (CEA) preparation.22 Hull等2019在烟草中表达了炭疽杆菌维护抗原特异性单克隆抗体,在活体内外均表现出毒素中和活性,这项研讨阐明用植物消费炭疽杆菌单克隆抗体可以胜利地用于预防。23 在放大31207倍的高倍显微镜下，拍到了斯

10、特恩炭疽杆菌的孢子。这些孢子可存活很多年，这使得炭疽杆菌能在休眠形状下存活。 24能消费狂犬病抗体的烟草25 植物不仅作为生物反响器消费抗体用于医药产业，而且植物抗体介导的免疫调理在植物抗病育种上也很值得研讨。 Fecker等(2000)将抗甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的外壳蛋白基因的scFv转化烟草，产生的scFv定位于细胞质中或经过末端的衔接信号肽而分泌到质外体，结果发现转scFv的植株出现病症的时间明显迟于对照。26 另外，在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体，从而对细胞代谢进展调理，这对于植物代谢机理的研讨非常有用。27 传染病严重要挟人类的生命和安康，不断以来人类获得免

11、疫预防主要经过疫苗接种。但在开展中国家，昂贵的疫苗呵斥数百万人尤其是儿童依然死于传染病。 目前利用植物作为生物反响器消费口服疫苗，极大降低了疫苗的消费本钱，并且研讨阐明植物疫苗确实可以使人和动物产生相应的免疫应对，因此这一新技术将有助于疫苗的普及从而改善开展中国家人民的安康情况。28转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,消费出能使机体获得特异抗病才干的疫苗。转基因植物疫苗有两个研讨方向: 一种是利用植物消费大量的蛋白质抗原，经分别和提纯再制备成疫苗；另一种是不需求分别和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。与注射疫苗相比,可食疫苗具有本钱低,便于运输储存及运用方便等优

12、点,因此成为基因工程疫苗的研讨热点。29 目前，科学家正在进展植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗糖尿病疫苗以及利用植物消费加强免疫效应的辅助佐剂方面的研讨 。 Tacket等2000将转诺沃克病毒外壳蛋白基因的马铃薯让20个志愿者服用，结果19个人产生特异性IgG，6个人产生特异性IgA，阐明95%的人对诺沃克病毒产生了抵抗力。30 Shchelkunov等2019初次研讨了一种能同时抗两种病毒的疫苗，将编码艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝外表抗原的嵌合基因导入番茄并得以表达。31 Li等2019将霍乱毒素B亚基ctb基因交融到糖尿病本身抗原基因中，用来转化低烟碱烟草，对产物

13、进展功能性分析后，发现该交融蛋白具有与天然CTB一样的生物活性及免疫活性，包括GM1神经节苷酯受体结合才干，阐明CTB3/InsB3 交融蛋白可经过诱导口服免疫耐受才干来预防和治疗本身免疫糖尿病。32 迄今在植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒外表抗原(hepatitisB surface antigen， HbsAg)，诺沃克病毒(Norwalk virus)外壳蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)、霍乱毒素的A，B亚基(CT-A，B)、冠状病毒(Corona virus)的免疫原糖蛋白S多肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒(foot-andmouth diseasevirus)抗原

14、、水貂肠炎病毒抗原、犬细小病毒抗原。 33 研讨人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿，但这些植物作为口服疫苗都存在缺陷，如烟草不能食用，马铃薯不易生食，而西红柿不易长期储存。 因此更宜于消费口服疫苗的是那些含有大量可溶性蛋白、耐贮运的种子植物，特别是水稻、小麦、玉米，其胚乳中含有丰富可溶性蛋白可以与种子其他部分分开，从而降低植物疫苗服用剂量。 此外，植物必需高程度表达疫苗才干到达口服免疫的效果。 v.youku/v_show/id_co00XMTcxNDA4MDQ=.html 34 植物作为生物反响器除了可以消费抗体疫苗外，还可表达细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等。 但是利用

15、植物消费上述细胞因子、酶、药用蛋白和生物活性肽等需求下游纯化，只需它占总可溶性蛋白(Total soluble protein，TSP)的1%以上才具有商业开发的价值。 35 Verwoerd等2019将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即植酸酶)基因转入烟草，在成熟种子中植酸酶占总可溶性蛋白的1%。 Witcher等2019利用转基因玉米消费重组的-葡萄苷酸酶(GUS)，表达程度高达种子总可溶性蛋白的0.7%，且生物活性与天然的的GUS一样。 植物性饲料中，约有70%的磷以植酸磷的方式存在。由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸磷的植酸酶，故导致植物性饲料中总磷的消化利用率很低。植酸酶可水解植酸，提高植物性饲

16、料中总磷的利用率。 36 Hood等2019在转基因玉米中胜利表达了重组抗生物素蛋白，其表达量占总可溶性蛋白的2%。与从鸡蛋清中提取的相比具有一样的效果而本钱却大大降低了。现已成为Sigma-Aldrich的商品。 Moloney 2019等将人的亮氨酸脑啡肽基因导入油菜中，先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的方式表达，再用胰蛋白酶水解，获得的脑啡肽产量到达220nmol/g种子，脑啡肽临床可作为止痛剂或镇定剂。 37 此外，在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前曾经在加拿大投入商业消费，这是第一个用来商业开发的范例。 38 水蛭素是水蛭蚂蟥的唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前知的最强有力的凝血酶的

17、天然抑制剂。对多种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，特别是对外科手术后及深栓治疗后的再栓塞有重要的预防和治疗效果。因此，水蛭素将成为新的抗凝血抗血栓构成的药物。39 Sijmous等人将人血洁白蛋白(human serum albumin，HSA)编码区与烟草的一个蛋白分泌信号肽序列的交融基因转入马铃薯，表达的交融蛋白占总可溶性蛋白的0.02%.40 此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干扰素的含量低于0.03%(鲜重)、促红细胞生长因子(EPO)占总可溶性蛋白的0.003%。人工合成的人表皮因子在烟草 中 的 表 达 量

18、 仅 到 达 总 可 溶 性 蛋 白 的0.001%，因此尚不具备开发价值，需经过进一步的研讨来提高表达量。 41胰岛素4243 关于工农业用蛋白质在植物中表达的报道： 首先进展商品化的两种转基因植物消费的蛋白分别是利用转基因玉米消费的鸡源抗生素亲和素和大肠杆菌来源的葡糖醛酸酶，它们都运用于分子生物学中作为诊断试剂盒。44 亲合素Avidin在诊断试剂中的运用非常广泛，它是蛋清中比较丰富的一种真核生物蛋白，在常规情况下可从蛋清中直接分别纯化。 在转基因玉米中研讨消费这种蛋白，以确定它能否可以与蛋清来源的鸡亲合素进展商业化竞争。将一个鸡亲合素蛋白的编码序列按照玉米偏爱的密码子进展优化，然后与大麦

19、-淀粉酶信号肽编码序列交融，并导入玉米染色体中表达。 45 每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素，据估计这种玉米来源的亲合素本钱约比蛋清来源的亲合素低10倍。玉米亲合素具有与天然蛋白一样的生物活性，如今成为商品公开出卖见Sigma-Aldrich product#A8706。 46 利用转基因植物消费的-葡萄糖醛酸酶GUS也曾经商品化。 gus基因是报告基因reporter gene，是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，其来自于大肠杆菌，编码-葡萄糖醛酸糖苷酶或-葡糖醛酸酶-glucuronidase，GUS，能催化裂解一系列的-葡萄糖苷

20、，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进展定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。47 Zeigler等2000报道了细菌的纤维素酶在拟南芥中的表达，其表达量高达25%。48动物血红蛋白灵芝和烟草49表2 利用转基因植物表达的其他药用蛋白(2019年后)药用蛋白药用蛋白表达植物表达植物用途用途参考文献参考文献人酸性人酸性-葡萄葡萄糖苷酶糖苷酶烟草烟草治疗葡萄糖脑苷脂酶治疗葡萄糖脑苷脂酶缺乏症缺乏症ReggitReggit，20192019人血清蛋白人血清蛋白水稻水稻治疗低清蛋白血症和治疗低清蛋白血症和外伤性休克外伤性休克Uuangt, 2019 Uuangt

21、, 2019 人乳铁蛋白人乳铁蛋白水稻水稻免疫系统调节免疫系统调节, ,促细胞促细胞生长生长Nandit, 2019Nandit, 2019胰升糖素样肽胰升糖素样肽水稻水稻治疗糖尿病治疗糖尿病YasudatYasudat，2019201950续表药用蛋白药用蛋白表达植物表达植物用途用途参考文献参考文献白细胞介素白细胞介素- -12 12 番茄番茄抗肿瘤免疫和抗病抗肿瘤免疫和抗病毒免疫毒免疫G-OrRgat, G-OrRgat, 20192019血栓调节素血栓调节素烟草烟草治疗血栓治疗血栓SchinkeltSchinkelt，20192019基本成纤维细基本成纤维细胞生长因子胞生长因子大豆大豆治

22、疗心血管及神经治疗心血管及神经变性疾病变性疾病Dingt, 2019Dingt, 2019人骨形态发生人骨形态发生蛋白蛋白-2 -2 烟草烟草促进骨愈合促进骨愈合Suot1, 2019Suot1, 201951续表药用蛋白药用蛋白表达植物表达植物用途用途参考文献参考文献人人-L-L-艾杜艾杜糖苷酸酶糖苷酸酶烟草烟草治疗人溶酶体贮存障碍治疗人溶酶体贮存障碍Kermodet, Kermodet, 20192019人表皮生长因人表皮生长因子子烟草烟草治疗创伤烧伤治疗创伤烧伤, ,溃疡及溃疡及角膜外伤角膜外伤BaitBait，20192019人成纤维细胞人成纤维细胞生长因子生长因子8b8b烟草烟草癌症

23、靶向治疗癌症靶向治疗Potuat, Potuat, 20192019人人-1-1抗胰蛋抗胰蛋白酶白酶番茄番茄治疗肺气肿治疗肺气肿, ,纤维囊泡纤维囊泡症症, ,肝癌肝癌AgaiwaltAgaiwalt，20192019人生长激素人生长激素水稻水稻治疗侏儒症治疗侏儒症, ,骨折骨折, ,皮肤皮肤烧伤烧伤, ,出血性溃疡出血性溃疡Kimt, 2019Kimt, 201952 植物基因工程消费药用蛋白的过程普通包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培育和植株再生、转化植株栽培、目的产品的分别纯化及纯度鉴定等，其中载体表达系统主要有两种：稳定的整合表达系统和瞬时表达

24、系统。 534.1 转基因植物稳定整合表达系统转基因植物稳定整合表达系统 外源基因导入宿主细胞并整合到宿主基因组中，且可以稳定表达目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。 利用农杆菌介导法或DNA直接转移法，把编码生物活性蛋白的外源基因或编码构造性抗原决议簇参与诱导维护性免疫应对的病原体DNA导入植物细胞，并整合到植物细胞染色体上。54 整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，并在生长过程中表达生物活性蛋白和疫苗，同时把能表达异源性蛋白的性状遗传给子代，构成稳定的表达生物活性蛋白的植物品系。55 Ponstein 等(2019)未来源于A. niger 植酸酶phy基因转移到油菜籽中

25、，用种子特异性启动子CruA控制phyA ，并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信号肽序列，结果发现95的油菜籽实中检测到了植酸酶的活性，此酶对胃蛋白酶具有抗性。 564.2 重组植物病毒瞬时表达系统重组植物病毒瞬时表达系统 瞬时表达系统是利用可在植物中自行复制的植物病毒为载体表达异源蛋白。 植物病毒具有广寄主性，可以感染多种植物，且基因组小，易于进展遗传操作。 以植物病毒为载体，将编码生物活性蛋白的基因或编码疫苗抗原决议簇基因插入植物病毒基因组中，并置于强启动子的控制下，然后用此重组病毒感染植物，外源基因即随病毒的复制而高程度表达接种后12周，从已感染病毒的叶片中提取病毒蛋白，酶解后即可获得目的蛋

26、白。57 普通病毒蛋白可以占到感染病毒叶片总蛋白含量的50%。外源蛋白产生的方式或是独立的多肽，或与病毒基因产物交融。 大多数植物病毒可借助快速的机械接种感染植物，适宜于大规模的商业化消费，利用这类方法有望获得高产量的药用蛋白，实现消费蛋白质的“绿色工厂。58 将构建好的外源性基因的病毒载体导入植物主要采用的是体外接种法。 目前已有十几种植物病毒被改呵斥不同类型的外源 蛋 白 表 达 载 体 ， 包 括 花 椰 菜 花 叶 病 毒CaMV 、烟草花叶病毒TMV和豇豆花叶病毒CPMV 等，其中有150 多种蛋白多肽在TMV 载体中胜利表达。例如： 594.2 重组植物病毒瞬时表达系统重组植物病毒

27、瞬时表达系统双链DNA花椰菜病毒CaMV，能感染十字花科和少数非十字花科如茄科植物;单链RNA烟草花叶病毒TMV，是一种复制量和外壳蛋白质表达量很高的病毒，具有寄主范围广、能在整体植物上快速分散等特点，多年来，人们研讨了利用TMV表达外源基因的多种战略，目前已有150 多种蛋白多肽在TMV 载体中胜利表达。 604.2 重组植物病毒瞬时表达系统重组植物病毒瞬时表达系统此外还有单链DNA番茄金黄花叶双病毒(TGMV)、非州木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)、大麦条文花叶病毒(BSMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草蚀刻病毒(TEV)

28、、李痘病毒(PPV)等 。616.4.3 两种系统的比较植物稳定整合表达体系植物稳定整合表达体系重组植物病毒瞬时表达系统重组植物病毒瞬时表达系统可通过有性或无性繁殖获得大可通过有性或无性繁殖获得大量转基因后代，可大规模生产量转基因后代，可大规模生产通过接种获得高产量蛋白表达通过接种获得高产量蛋白表达,但不能遗传但不能遗传,不便大规模生产不便大规模生产生产周期长，一般为生产周期长，一般为1年；纯年；纯合转基因系要合转基因系要34年以上年以上生产周期短，一般约生产周期短，一般约14个月个月可表达大片段外源基因可表达大片段外源基因只能表达小肽和表面决定基只能表达小肽和表面决定基表达量低，小于表达量低

29、，小于1%TSP表达量高，可达表达量高，可达1%5%TSP62 5.1 外源蛋白表达的程度低外源蛋白表达的程度低 这个问题普遍存在于转基因植物的研这个问题普遍存在于转基因植物的研讨中，对于植物疫苗来说，表达量必讨中，对于植物疫苗来说，表达量必需到达较高程度，才干到达口服免疫需到达较高程度，才干到达口服免疫的效果，而对于在植物中表达需求纯的效果，而对于在植物中表达需求纯化的抗体以及药用蛋白时，只需当其化的抗体以及药用蛋白时，只需当其超越总可溶性蛋白的超越总可溶性蛋白的1%，才具有商业，才具有商业开发价值。开发价值。 63 为了进一步提高外源蛋白在植物细胞中的表达程度，人们设计了很多战略: (1)蛋白质的靶向定位。在高等植物叶绿体表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。叶绿体环形基因在每个植物细胞中可达5001000个，可显著提高外源基因的拷贝数，从而使基因表达产物成倍添加，甚至可达总可溶性蛋白的47%。 64 (2)运用植物病毒作为表达载体，可大大提高外源基因的表达程度。 (3)运用植物偏爱的密码子，植物中遗传密码子的运用频率与动物、微生物不同。适当地对外源基因的密码子进展交换能显著提高该基因在植物中的