PCR,不只是温度循环ppt课件

1、2022-1-29杭州博日科技肖强海12022-1-29变性退火延伸N个循环22022-1-29n模板DNAn特异性引物n热稳定DNA聚合酶n脱氧核苷三磷酸dNTPn二价阳离子Mg2+/Mn2+n缓冲液Tris-Cln一价阳离子KCl232022-1-29n反复性差n假阳性n假阴性n扩增效率低nCt值出现的晚n规范曲线线性不佳WHY?42022-1-294Mg2+TaqKCl引物模板产物dNTPEDTA腐殖质盐离子盐离子模板引物复合物活性构象螯合螯合螯合BufferDDTTween甘油52022-1-29n引物与引物，引物与模板的不同部位都会有一定的结合力，只是大小有差别，取决于温度与浓度nD

2、NA聚合酶与引物，与双链DNA模板和产物，与模板引物复合体都能结合，只是与后者结合力更强nDNA聚合酶与DNA的结合是动态的，在不断的结合与分别nDNA分子之间的结合，以及聚合酶与DNA分子之间的结合发生的温度范围很广，并非只需退火的时候才发生。温度和时间决议了哪个产物能胜出温度和时间决议了哪个产物能胜出62022-1-29n成分控制n体积控制n温度控制n时间控制672022-1-29n核酸抽提试剂n引物合成能够有杂质n商品化的PCR试剂盒未标明成分782022-1-29n移液器n吸头n操作手法892022-1-299金属底座散热器耗材导热膜反响试剂半导体温度探头102022-1-2910试剂

3、仪器耗材人人模板序列模板引物二级构造GC含量完好度抑制剂二聚体错配让厂商去优化吧112022-1-29nPCR全部循环跑完再检测一次产物量，在电泳仪上分别后，用EB等染料染色，在紫外灯下检测。n经过荧光分子标志，QPCR每跑一个循环都检测一次产物量，无需任何分别，在QPCR仪内直接检测。n一个PCR反响产物检测只得到一个数据，只能粗略判别终产物的量。n一个单色QPCR跑40个循环可以检测到40个数据，可以更准确的推断出DNA的量。122022-1-29n荧光是一种光致冷发光景象。荧光分子经某种波长的入射光通常是紫外线或X射线照射，吸收光能后进入激发态，并且立刻退激发并发出出射光通常波长比入射光

4、的的波长长，在可见光波段；而且一旦停顿入射光，发光景象也随之立刻消逝。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。12荧光分子的性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、黏度等改动而灵敏地改动。132022-1-29n非特异性荧光染料：非特异性荧光染料：n1、 SYBR Green n特异性荧光探针：特异性荧光探针：n 2、TaqManTaqman-MGB)n 3、Molecular Beaconn 4、LNA probesn 5、Scorpions primers n 6、FRET proben 7、Allglo探针探针n 8、蝎形引物、蝎形引物Scorpion

5、primer：荧光标志引物：荧光标志引物n 9、Amplifluor：荧光标志引物：荧光标志引物SYBR Green，FAM，HEX，VIC，TET，JOE，CY3，TAMRA，NED，ROX，CY5，LC-Red等等142022-1-29nExcites at 497 nm and emits at 520 nm.152022-1-29 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只需和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，构成双链DNA， SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。162022-1-29q 对DNA

6、模板没有选择性q -适用于任何DNAq 运用方便q -不用设计复杂探针q 非常灵敏q 廉价优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 q 但可以经过融解曲线的分析，优化反响条件q 对引物特异性要求较高缺 点172022-1-29TaqMan-水解型杂交探针与目的序列互补v 5端标志有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标志有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完好，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针182022-1-29TaqMan-水解型杂交探针荧光素非荧光淬灭基团与目

7、的序列互补MGB(Minor Groove Binder)将探针的Tm值提高10因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合本钱钱，也使得探针设计的胜利率大为提高。TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。192022-1-29每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光202022-1-29q对目的序列的高特异性-阴性结果确定q设计相对简单-与目的序列某一区域互补q反复性比较好优 点q只适宜一个特定的目的q委托公司标志，价钱较高q设计及实验难度大q不易找到本底低的探针缺 点212022-1-29反响体系的建立及优化:防止非特

8、异产品SYBR Green 运用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否那么扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反响Buffer 体系的优化反响温度和时间参数:由酶和引物决议其他与常规PCR一样EVA Green、LC Green222022-1-29n 起始模板的测定n 基因型的分析n融解曲线分析：可以优化PCR反响的条件，对常规PCR有指点意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物。nHRM232022-1-291、引物、探针的设计：探针优先于引物 有软件可以辅助设计：Pri

9、mer5、beacon design、Primer Express 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G能够会淬灭荧光素， 引物尽量接近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反响参数确实定运用梯度功能 普通为：94 ，10-20S 60，30-60STaq酶53外切核酸酶活性在60 最高 也可经过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR一样242022-1-29q 起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP

10、单核苷酸多态性分析252022-1-29环茎荧光素 淬灭剂标志荧光的发夹探针 环与目的序列互补茎由互补配对序列组成发夹型杂交探针发夹型杂交探针262022-1-29n探针游离时，呈发夹构造，不能检测到荧光n互补序列出现时，探针与DNA结合，探针转变成开放的线性构造，产生可被检测的荧光。272022-1-29q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP单核苷酸多态性分析282022-1-29q高特异性：对目高特异性：对目的序列的序列q 检测检测SNPSNP最灵敏最灵敏的试剂之一的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目的q 设计困难q 价钱比较高缺 点292022-1

11、-29nLNA probes- Locked Nucleic Acids碳环引入亚甲基桥，提高Tm的作用nScorpions primers 302022-1-29nFRET probenAllglo探针n蝎形引物Scorpion primer：荧光标志引物nAmplifluor：荧光标志引物n其他312022-1-29n绝对定量：用知量的规范品做规范曲线，推算未知的样本中基因的拷贝数或浓度。n相对定量：样本中目的序列相对于另一参照样本的量的变化。常用于比较样本中基因表达程度的高低变化，得到的结果是百分比。nSNP基因分析n其他31322022-1-29荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件

12、扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数横坐标：扩增循环数CycleCycle；纵坐标：；纵坐标：荧光强度荧光强度 每个循环进展一次荧光信号的搜集每个循环进展一次荧光信号的搜集332022-1-29CtCt值的特点：值的特点：一样模板进展一样模板进展9696次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定； Ct Ct值那么极具重现性值那么极具重现性342022-1-29nCycle of thresholdnPCR反响管中的荧光信号到达特定值threshold，阈值时候的所需求的循环数。n不同的数据分析方法样点拟合法/基线阈值法，最大二阶导数法得到的Ct值不同，普通选用前者。343

13、52022-1-29Ct值的定义值的定义-样点拟合法基线阈值法：样点拟合法基线阈值法： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号到达设定扩增过程中，扩增产物的荧光信号到达设定的域值时所经过的扩增循环次数的域值时所经过的扩增循环次数C(t) value 362022-1-29荧光信号阈值荧光信号阈值 threshold threshold ： 前前1515个循环信号作为荧光本底信个循环信号作为荧光本底信号号baselinebaseline，即样本的荧光背，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是荧光域值的缺省设置是3 31515个循个循环的荧光信号的规范偏向的

14、环的荧光信号的规范偏向的1010倍倍 手动设置：原那么要大于样本的手动设置：原那么要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于最初阶段，并且保证回归系数大于0.990.99 真正的信号真正的信号: :荧光信号超越域值荧光信号超越域值372022-1-29Ct值的定义值的定义-最大二阶导数法：最大二阶导数法： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号变化最大时扩增过程中，扩增产物的荧光信号变化最大时所经过的扩增循环次数。反复性好，但对曲线要求高。所经过的扩增循环次数。反复性好，但对曲

15、线要求高。382022-1-29Sampleq 模板DNA量越多，荧光到达域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，经过知起始拷贝数的规范品可作出规范曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量25绝对定量绝对定量392022-1-29n绝对定量的规范样品：绝对定量的规范样品：n 知拷贝数的质粒知拷贝数的质粒DNA和体外转录的和体外转录的RNA假病毒假病毒 n用于生成规范曲线的样品如何设定？用于生成规范曲线的样品如何设定？n1.含有和待测样品一样扩增片段的克隆质粒或含有和待测样品一样扩增片段的克隆质粒或cDNAn2.紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或

16、荧光酶标测定浓度n3.根据质粒或根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀释释402022-1-29n相对定量中的内标看家基因相对定量中的内标看家基因n内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，n 受环境要素影响小受环境要素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量nCt, Ct法法n目的基因、看家基因目的基因、看家基因n对比样本、待测样本对比样本、待测样本412022-1-29n核酸浓度定量n

17、环境微生物的监测n转基因植物中外源基因的检测n基因转录的检测422022-1-29n对病原DNA的检测n染色体病的诊断n基因病的诊断n药效考核n肿瘤研讨432022-1-29起始资料模板DNAPCR扩增荧光检测数据处置结果分析核酸抽提，反转试剂人为操作影响仪器，耗材，试剂软件442022-1-2944452022-1-29n不同品牌的仪器之间有什么区别n加热不同半导体之间的差别n导热底座资料的差别n散热散热片的材质，外形，大小，风扇的大小，转速，寿命n功率n升降温的速度，战略n电源，电流电压的稳定性n光学信号检测的实现方式不同462022-1-29n数据处置算法不一样n分析方法不一样47202

18、2-1-29n温度循环参数的影响n荧光增益值的影响n背景校准参数的影响482022-1-29n酶的活性扩增效率不一样n荧光分子质量发光强度不一样n组分不同适用的模板不一样，扩增效率不一样n纯度n优化程度492022-1-29n板n消费厂家的模具精度，稳定性，批间差影响加热或荧光采集n顺应的机型不一样n膜n透明度影响荧光信号采集n稳定性，耐热性，粘度液体蒸发n移液器n枪头n模具精度不够，气密性不一致影响加样一致性502022-1-2950512022-1-29n起始资料的质量n核酸抽提方案的选择n抽提试剂的选择n反转录试剂的选择522022-1-29n加样的准确性n样品能否混匀n膜能否封的严实5

19、32022-1-29ndNTP，Buffer，酶，引物，模板，H2O，Mg2+n仪器，软件，电脑，n板材，管，膜n移液器，枪头542022-1-29n耗材和仪器不兼容n试剂在某个机型上效果不好n试剂和耗材配合不好n各种产品种类繁多，消费厂家繁多n厂家虽然本人的产品到达好的效果，很难思索下游实验的效果54552022-1-2955562022-1-2956试剂仪器耗材来自同一个厂商的产品会做好各种兼容性测试，保证了实验效果用户不再是小白鼠用户不再是小白鼠572022-1-29n省时省力省钱n把时间和精神花在科学问题上n早出结果，早发文章n出好结果，发大文章57582022-1-29n试剂摆放n前

20、后一致的加样方式n时辰察看n各个试剂组分的配置浓度要适宜592022-1-2959602022-1-29三区分隔规划-加强防污染612022-1-29622022-1-29n药厂n学校632022-1-29n定量PCR价值高，人人都要运用维护困难n定量PCR是一种高精细的电子机械产品机器内有电子元器件也有机械运动部件n有精细的温控系统和光学系统n怎样的运用和维护才干保证仪器的运用寿命及检测结果的准确性？642022-1-29n仪器放置对环境的要求n防水n防尘干净空间n防电磁干扰周围不能有大型设备n防电网动摇-运用UPSn避光不能放在有光线变化的环境下n通风给仪器一定的生存空间n电脑公用的电脑、

21、防病毒652022-1-29n仪器运用的要求n仪器安装必需按照运用阐明书进展n升降温速度最高速度与平均速度n极限温度能不用就不用n开机时间运用终了后及时关机，维护光电系统n运用高质量的定量PCR管必需是底部透明662022-1-29n仪器实验做不出来的能够缘由n机器坏了n试剂坏了n操作失误n模板坏了n仪器间差别n环境的差别672022-1-29n仪器维护的要求n仪器的清洁防污染n模块的清洁减小本底差别n长期不用n定期用可靠的试剂做仪器性能测试均一性检测，假设差别偏大就要咨询厂家682022-1-29692022-1-29占地面积 26，000 M2拥有一万级的净空房、大型超净实验室、GMP试剂

22、车间、中心实验室等一流的环境和设备。建筑面积 16，000 M2702022-1-29中国最大的生命科学仪器消费厂家亚洲最大的PCR仪专业消费基地A REMARKABLE SUCCESS STORY让我们从这里 开启一段博日之旅博日科技712022-1-29有 序专 注严 格博日制造公司概略公司概略科学仪器制造722022-1-29产品谋划产品设计产品调试产品验证研 发公司概略公司概略732022-1-29 公司简介 07 BIOLOGICAL PIONEER制造优势742022-1-29公司概略公司概略质量保证752022-1-29公司概略1992瞩目过去，放眼未来！20192019年 成立 Ferrotec中国集团研发小组2019全球最大的半导体制冷片消费基地！中国 杭州公司概略开展背景2019年 杭州博日科技正式成立2019762022-1-2976公司概略公司概略开展背景 2019 立志成为中国生命科学领域的先锋初期市场探求阶段公司品牌初创阶段 201920192000201920192019Ferrotec中国研发小组成立博日科技成立涉足生命科学仪器2019-如今-