实验七连续记录法测定过氧化氢酶的活力

1、目的了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算.原理过氧化氢酶（Catalase, CAT，EC 1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一，其催化的反应为：2H2O23 % 2 HQ + 07通过上述反应，CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧 化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。传统测定CAT活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且 比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优 点。测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比

2、色皿 中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于H2O2在240nm处有吸收峰，加入酶液后会使A240下降，而A240下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240 min-1,最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出 DA240- min-1 g-1Fw并以此来表示样品中 CAT活力的大小。三.实验材料及设备1. 材料小麦叶片（或其它禾本科植物叶片）2. 仪器电子天平高速冷冻离心机记录仪紫外分光光度计3. 器材层析柱：1套刻度试管：5mLX10移液管： 5mLX1微量进样器：1000ml >1 200ml XI （可调）塑料离心管：7mLX1小试管：1支滴管：

3、 2洗耳球： 2硫酸纸 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四 . 试剂的配制1. 提取缓冲液（0.05mol/L、pH7.0 PBS，内含 l%PVP）2. CAT 反应液（0.05mol/L、pH7.0 PBS，内含 0.015mol/L H2O2）3. 层析介质： Sephadex G-25五 . 操作步骤1. 粗酶液的制备（1）取材：称取 0.5g 左右的生物材料，记下实际质量。（2）研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的提取缓冲液5mL ,置冰浴上充分研磨。（如不易研磨，加少量石英砂。）（3）离心：匀浆液全部转入 7mL塑料离心管，平衡后于 4C下、以10,000g离心10分钟。

4、 上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为粗酶液，置于冰浴中备用。2. 粗酶液的初步纯化（1）上样：用可调微量进样器或移液管吸取1mL 粗酶液过 Sphadex G-25 小柱（总床体积7mL ）（参照凝胶层析脱盐”实验的上样步骤）。（ 2）收集：每管收 2mL ，共收集 4 支试管，然后关闭出口。（3）检测：将收集到的洗脱液每管取0.4mL 到相应的另一支空试管中， 用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质 。（ 4）合并：将检测到 含有蛋白质的对应的几支管等体积混合，摇匀，即为初步纯化的粗酶液，置于冰浴中备用。3. 酶活力测定波长定于 240nm 处， 记录仪的量程定于 50mV 处，（

5、1） 紫外分光光度计与记录仪相连接， 预热 10min ，仪器调零。（2） 在光径为 1cm 的石英比色皿内，步纯化的粗酶液后（视酶活力大小而定），用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次 （不要过先加入 3mL CAT 反应液， 再加 0.1mL 的粗酶液或初 分剧烈颠倒）；立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min 处， A240 的变化情况被记录于纸上。 3min 后关闭纸速开关。（3）重复步骤（2），再测定12次。六 . 结果处理1. 在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值，得 从240 min-1,（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收A240 ），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值；2. 根据活力测定的酶液加入量、 酶液总体积和样品鲜重， 计算植物样品中 CAT 活力， 以 -1 -1AA240 min g Fw表示（包括粗酶液与初步纯化的粗酶液）。七 . 思考题1什么是酶反应进程曲线？它对酶活力