新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响

1、新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响    作者：陈绍倩,杜英,黄玉敏,王鑫,顾巧丽,董子明    【摘要】 本研究探讨新型趋化因子CKLFSF8对人白血病HL?60细胞的增殖和表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响，应用RT?PCR方法检测CKLFSF8基因在HL?60细胞中的表达；利用脂质体将CKLFSF8基因转染到HL?60细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长；MTT法检测细胞的增殖程度；免疫细胞化学法检测CKLFSF8基因转染前后HL?60细胞EGFR的表达。结果表明： 在细

2、胞生长过程中可检测到CKLFSF8表达；CKLFSF8基因转染前后HL?60细胞的增殖受到了明显的抑制，与空白对照组和空质粒组相比有显著性差异（P?0.05）；对比转染前后细胞EGFR表达的阳性率具有显著性差异（P?0.01）。结论： CKLFSF8基因转染对白血病细胞HL?60的增殖和EGFR的表达有明显抑制作用。    【关键词】 CKLFSF8； HL?60细胞； 细胞增殖； EGFR Effects of Novel Human Chemokine?like Factor Superfamily 8 on Proliferation and EG

3、FR Expression of HL?60 Cells    Abstract    This study was aimed to investigate the effect of chemokine?like factor superfamily 8 (CKLFSF8) on proliferation and expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) of HL?60 cells. Expression of CKLFSF8 mRNA on

4、 HL?60 cell line was assayed by RT?PCR; the target gene was transfected into the cells by lipid vector, cell proliferation was determined by MTT assay, while expression of EGFR in HL?60 was determined by immunocytochemical technique. The results indicated that expression of CKLFSF8 existed in HL?60

5、cells. After transfection, cell proliferation was inhibited (P?0.05) and the expression of EGFR in HL?60 cells was also discovered to be inhibited (P?0.05). It is concluded that the proliferation and expression of EGFR in HL?60 cells can be inhibited by transfection of CKLFSF8. The novel chemokine m

6、ay provide a new approach in the treatment of leukemia.    Key words    CKLFSF8; HL?60 cell; cell proliferation; EGFR    趋化因子（chemokine）是一组具有趋化活性的小分子蛋白质,在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应及AIDS的演化等过程中发挥重要作用1。趋化素样因子超家族成员8 (chemokine?like factor superfamily，

7、 CKLFSF8)是新近发现的新型人类趋化因子。研究发现，大多数细胞内都有该因子的表达，在肝脏、肺脏和胰腺细胞内高表达；CKLFSF8 在某些肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达2，但有关CKLFSF8对肿瘤细胞表皮生长因子影响的研究报道尚少。为了探讨这种新的趋化因子在白血病的发生发展中的作用，我们选择白血病细胞株HL?60为研究对象，观察新型细胞因子CKLFSF8对HL?60的增殖和表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor， EGFR)表达的影响。    材料和方法    菌株

8、和质粒    E.coli DH5购自Gibco公司。带有目的基因片段CKLFSF8的质粒pCDNA3.1和pEGFP由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授惠赠。人白血病限制性内切酶EcoR、BamH为TakaRa产品。质粒提取试剂盒为Vegen产品。RPMI 1640及TRIZOL RNA提取试剂为Gibco产品。RT?PCR试剂为上海生物工程技术有限公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。转染试剂 LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。山羊抗人EGFR抗体为Santa Cruz公司产品。免疫组织化学试

9、剂盒为北京中杉生物技术有限公司产品。    HL?60细胞的培养和RNA的提取    将HL?60细胞接种于含100 ml/L小牛血清的RPMI 1640 培养液，置37 5% CO2培养箱中常规培养。取生长旺盛的HL?60细胞，按TRIZOL试剂盒说明书提取肿瘤细胞总RNA。    HL?60细胞CKLFSF8的检测    采用RT?PCR法，将HL?60细胞总RNA进行反转录。根据CKLFSF8 mRNA序列设计引物，上游为 3&#

10、39;?GCCTTCATGAGTCAAGGTCGT?5'，下游为5'?AGA? GAGGTAGAAGACGAAGGC?3'。PCR反应条件94 7分钟,94 30秒,59 30秒,72 40秒,72 7分钟，共进行35个循环。 ?actin做内对照。10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物片段。    质粒扩增和鉴定    制备感受态细胞，用质粒pCDNA3.1CKLFSF8进行转化，涂在含有氨苄青霉素的培养基上，37培养12小时，挑取单个菌落，37震摇培养3小时，按质粒提取试剂盒方法提取质

11、粒。将质粒分别进行EcoR单酶切和EcoR、BamH双酶切。琼脂糖电泳鉴定获得的CKLFSF8基因片段。    CKLFSF8基因转染HL?60细胞    按试剂盒使用说明书进行转染。取1×106个处于对数生长期的HL?60细胞，用无血清培养基洗2次，用500 l无血清培养基接种于6孔培养板，将2 g带有目的基因片段CKLFSF8的质粒pCDNA3.1与10 l脂质体混合后缓慢均匀加到细胞表面，孵育5小时后更换2倍血清浓度的完全培养液，培养24小时。更换完全培养液，继续培养48小时收获细胞进行检测。首先以

12、带绿色荧光蛋白的质粒pEGFPCKLFSF8转染HL?60细胞来检测转染率。用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白表达的情况，计数10个视野的细胞，取平均值作为转染率。然后分别设未转染质粒的对照组、pCDNA3.1质粒对照组和pCDNA3.1CKLFSF8质粒转染组。    HL?60细胞增殖的检测    将200 l 105个转染细胞和对照组细胞分别加入96孔细胞培养板，每组3个复孔，37 5% CO2 培养48小时,每孔加入MTT（5 mg/mL）10 l ,继续培养4小时。小心吸出培养上清，每孔加入100 l二甲

13、基亚砜，震荡溶解颗粒,用酶标检测仪测定A570值。    CKLFSF8基因转染HL?60细胞前后EGFR表达的检测    采用免疫细胞化学方法检测。HL?60细胞做细胞滴片，用800 ml/L丙酮固定10分钟，pH 7.4 PBS冲洗，依次在标本片上滴加1500稀释的山羊抗人EGFR抗体，用PBS冲洗后，滴加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊二抗，DAB显色，光学显微镜下观察，阳性细胞是被染成棕色的细胞，各观察10个视野，计数200个细胞，计算EGFR阳性表达率。    阳性率

14、=(阳性细胞数/细胞总数) ×100%    统计学处理    实验所得数据用SPSS 11.5 软件进行t 检验,用均数±标准差( ±SD ) 表示。    结    果    CKLFSF8基因在HL?60细胞中的表达    白血病细胞株HL?60总RNA RT?PCR结果显示，在100-250 bp之间出现单一电泳带（图1

15、）。根据所设计引物和GeneBank中 CKLFSF8 mRNA的序列，扩增产物片段应为187 bp，与电泳带符合。这说明CKLFSF8基因在这种细胞中有表达。    Figure 1. mRNA expression of CKLFSF8 in HL?60. Lane 1: actin. Lane 2: CKLFSF8 fragment. M: marker DL2000.    CKLFSF8?pCDNA3.1质粒的酶切鉴定    质粒CKLFSF8?pCDNA3.1经E

16、coRI单酶切得到该质粒的全长DNA片段，为6 020 bp。经EcoRI和BamHI双酶切得到长度分别为5 500 bp和520 bp两个DNA片段，其中520 bp片段为CKLFSF8基因。    Figure 2. Restrictive analysis of the recombinant plasmid CKLFSF8?pCDNA3.1. Lane 1: CKLFSF8?pCDNA3.1/EcoRI BamHI. Lane 2: CKLFSF8?pCDNA3.1/EcoRI. M: DNA marker.   &

17、#160;CKLFSF8基因转染对HL?60细胞增殖的影响    与空质粒对照组和空白对照组相比CKLFSF8质粒组 A570值显著降低（P?0.01），而空质粒组和空白组无显著性差异（P?0.05）。这说明CKLFSF8对白血病细胞HL?60有明显抑制作用（附表）。    Table . Effect of CKLFSF8 on proliferation of HL?60 cells    GroupHL?60CKLFSF8? pCDNA3.10.65±0.12

18、*pCDNA3.10.98±0.06*Control group1.02±0.05*P?0.05 compared with control group；    *P?0.01 compared with control group and pCDNA3.1.    CKLFSF8基因转染对HL?60 EGFR表达的影响    荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况，并且经过计算得出脂质体介导的HL?60细胞的转染率是60.5。CKLFSF8质粒转染H

19、L?60细胞前后EGFR表达的阳性率比较，转染前阳性率为（94.0±2.23），转染后阳性率为（76.2±4.45）,差异具有统计学意义（P?0.01），说明CKLFSF8对HL?60细胞的EGFR表达有抑制作用。    讨    论    趋化因子是一组结构相似的小分子蛋白质，在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前2个半胱氨酸的相对位置不同，可分为CXC（）、CC（）、C（）和CX3C（）4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸3。北京大学人类

20、疾病基因研究中心从人单核细胞的前体细胞株U937细胞中分离出一种新的细胞因子命名为趋化素样因子1(chemokine?like factor 1， CKLF1)4，因其氨基酸序列中有3个半胱氨酸，最后2个连续排列，呈CC家族趋化因子的特征性结构，因此将其归为CC家族趋化因子5。随后运用生物信息学的方法,又发现与CKLF1有同源性的其它8个基因,分别命名为趋化素样因子超家族成员1-8(chemokine?like factor superfamily 1-8， CKLFSF1?8)6。其中，CKLFSF8基因位于第3号染色体（3p23），其cDNA全长1185 bp，其中第295?816位核苷酸

21、编码173个氨基酸组成的CKLFSF8蛋白分子，该蛋白属CKLF1 超家族成员，包括4个跨膜区和1个MARVEL（MAL?related proteins for vesicle trafficking and membrane link domain）结构域，该结构域与TM4SF（transmembrane 4 superfamily）结构相似，且CKLFSF8与TM4SF有39.5氨基酸相同3。CKLFSF8分子有2个变异体，分别由173和115个氨基酸残基组成。本实验就其中1个变异体即由173个氨基酸残基组成的趋化因子进行了研究。    在本实验中

22、，利用含CKLFSF8的pCDNA3.1质粒转染HL?60细胞，对转染前后细胞株中该因子的表达情况进行观察。结果显示，HL?60细胞能表达CKLFSF8，转染CKLFSF8后细胞内CKLFSF8过表达，细胞的增殖明显被抑制，与对照组相比有显著性差异。    表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，其编码基因又称erbB?1。EGFR与其配体结合后，通过自身磷酸化介导细胞内一系列的生长信号，促进细胞增殖。同时EGFR还能促进肿瘤部位新生血管的形成，而促进肿瘤的生长和

23、转移7。人类的多种肿瘤细胞中也可见EGFR和其配体的高表达8。临床研究显示，针对EGFR的药物和单克隆抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖9。因此，EGFR是与肿瘤生长明显相关的膜分子。为探讨CKLFSF8转染后细胞的增殖被抑制的可能机制，我们研究了转染后细胞表面EGFR的表达，结果显示CKLFSF8质粒转染HL?60细胞后EGFR表达明显降低，与对照组相比，有显著差异。    实验结果表明，趋化因子CKLFSF8基因可在HL?60细胞株中表达，转染该基因后白血病细胞过表达这种趋化因子，且该基因对HL?60细胞表面EGFR的表达有明显抑制作用，这提示CKLFSF8

24、可能通过抑制HL?60细胞EGFR的表达而达到抑制HL?60细胞生长的作用。    目前对于这种新型趋化因子的结构已经有了比较深入的了解，但是对于它的功能研究很少，后续还需作许多体内外相关实验，比如趋化实验、动物实验等，以便对这种新型趋化因子有更全面深入的了解，为这种新型趋化因子的应用打下坚实的理论基础。从对这种新型趋化因子的现有研究结果来看，有望对白血病的治疗提供新的思路。 【参考文献】 1Murooka TT, Ward SE, Fish EN. Chemokines and cancer. Cancer Treat Res, 2005; 126:15-442Lou Y, Xia D, Han W, et al. Molecular cloning and characterization of rat chemokine?like factor 1 and 2. Gene, 2003; 307: 125-1323Mantovani A. The chemokine system: redundancy for robust outputs. Immunol Today, 1999; 20: 254-2574徐明旭,程宁,杨松桦等. CKLFSF1 基因与CKLFSF2 基因间存