半枝莲提取物诱导结肠癌HT - 29细胞凋亡的机制研究-

1、结肠癌是世界上最常见的胃肠道肿瘤,在最常见的肿瘤中排第3位1。我国发病率低于西方国家,但近年来随着经济的发展,人们生活方式特别是饮食结构的变化,我国结肠癌发病率也呈逐年上升趋势2-3。半枝莲为唇形科植物半枝莲(Scutel -laria barbata D .Don.的干燥地上部分,性味辛、苦、寒,归肺、肝、肾、大肠经,具清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛等功能。半枝莲作为一种常用的抗肿瘤中药,对肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌、鼻咽癌等多种肿瘤细胞均有一定的抑制作用4-6。半枝莲抗肿瘤分子作用机制尚未完全阐明,本课题对半枝莲诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的机制进行研究。1材料1.1药物和细胞株半枝莲购自福

2、建中医药大学国医堂医院,批号:09021903。结肠癌细胞株(HT-29购自中南大学湘雅中心实验室。1.2试剂RPMI1640培养基、胰蛋白酶(trypsin 、胎牛血清(fetal bovine serum ,FBS ,Hyclone 公司;四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium ,MTT 干粉,Sigma 公司;DNA Ladder 试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、JC-1试剂盒,南京凯基生物科技发展有限公司;Caspase-3及Cas -pase-9检测试剂盒,Invitrogen 公司。1.3仪器B-290型实验室小型喷雾干燥

3、机(瑞士Buchi ,ELX800酶标仪(BioTek ;HF212UV 二氧化碳培养箱(Heal Force ,IX70荧光倒置相差显微镜(日本OLYMPUS ,Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统、APC 300型电泳仪(美国Bio-Rad ;流式细胞仪(BD 公司。2方法2.1半枝莲提取物(ESB 的制备半枝莲全草,用10倍85%乙醇回流提取2次,合并后过滤,回收乙醇,滤液浓缩至相对密度1.05,经喷雾干燥得粉末。得到的提取物用40%DMSO 溶解,配制成0.5g /mL 溶液,经高压灭菌后于4保存备用。2.2细胞培养将人结肠癌细胞株HT-29置于含10%热灭活胎牛血清(FBS 的

4、RPMI-1640培养液中,在37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。2.3MTT 法检测细胞增殖取对数生长期的细胞,用0.25%胰酶消化并收集。以RPMI1640培养液(含10%FBS 制成细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞密度为1×105个/mL ,接种于96孔培养板中,每孔100L ,常规培养24h ,使其同步化。分为4组,ESB 给药浓度分别为0、1、3、5mg /mL ,以上4组均设8个复孔。继续培养24h ,吸取各孔中的液体,每孔加入0.5mg /mL 的MTT 溶液100L ,37孵育4h ,然后吸取各孔中的液体,加入半枝莲提取物诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的机制研

5、究彭军1,林久茂1,魏丽慧1,徐伟2(1.福建中医药大学中西医结合研究院,福建福州350108;2.福建中医药大学药学院,福建福州350108摘要:目的探讨半枝莲提取物在体外诱导结肠癌HT-29细胞株凋亡的作用机制。方法采用人结肠癌细胞HT-29常规体外培养,随机设定对照组和不同浓度半枝莲提取物组,干预24h 。倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT 法测定不同浓度半枝莲提取物对HT-29细胞增殖的影响,DNA Ladder 试剂盒检测药物作用后细胞凋亡情况,AnnexinV-FITC /PI 双标记流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位变化,应用比色法分析Caspase-9和C

6、aspase-3的活化情况。结果半枝莲提取物干预HT-29细胞24h 后,HT-29细胞密度明显减少、细胞变小,可明显抑制HT-29细胞增殖,细胞凋亡增加,线粒体膜电位丧失,具有显著地剂量依赖,并出现明显的DNA Lad -der 条带;Caspase-9和Caspase-3的活化随着药物浓度的升高而增加。结论半枝莲提取物能通过线粒体通路诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。关键词:半枝莲;结肠癌;HT-29;细胞凋亡;线粒体中图分类号:R 282.71文献标志码:A文章编号:1004-5627(201006-0035-04收稿日期:2010-09-01基金项目:福建省自然科学基金

7、(2010J01195,福建省中西医结合老年性疾病重点实验室开放课题(2008J1004作者简介:彭军(1969,男,医学博士,硕士生导师,主要从事中医药分子作用机制研究。Journal of Fujian University of TCM December 2010,20(6福建中医药大学学报2010年12月第20卷第6期35图1ESB 对HT-29细胞增殖的抑制作用注:A.对照组(0mg /mL ;B.ESB (0.5mg /mL ;C.ESB (1.5mg /mL ;D.ESB (2.5mg /mL 。图2ESB 对HT-29细胞凋亡形态的影响(100×注:A.对照组(0mg

8、 /mL ;B.ESB (0.5mg /mL ;C.ESB (1.5mg /mL ;D.ESB (2.5mg /mL 。DMSO 100L /孔,振荡混匀,室温放置10min ,使结晶充分溶解并混匀,在全自动酶标仪570nm 处测定各组吸光度值(即A 值,并按下列公式计算增殖抑制率。抑制率%=(对照组A 值-实验组A 值/对照组A 值×100%。2.4细胞形态学观察HT-29细胞用不同浓度的ESB 培养24h 后,在倒置显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。2.5DNA Ladder 检测用0、1.5、2.5mg /mL ESB 处理HT-29细胞24h 后,用细胞刮刀收集细胞(细胞数1

9、05106个/mL 于1.5mL 离心管中,PBS 洗涤2次,按凯基细胞凋亡DNA Ladder 检测试剂盒步骤提取DNA 。最后取10L DNA 加入2L Loading Buffer ,于1.5%琼脂糖凝胶(凝胶和电泳缓冲液TBE 均加入0.5g /mL 的溴化乙啶,5V /cm 电泳1h ,紫外灯下观察并拍照。2.6细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC 流式细胞仪测定。细胞干预24h 后,先用不含EDTA 0.25%胰蛋白酶消化,制成单个细胞悬液,调整待测细胞的密度为5×1055×106个/mL 。取1ml 细胞用PBS 离心洗涤,1000r /min ,4离心

10、10min ,共3次,弃上清液。用500L 的Binding Buffer 重悬细胞,加入5L AnnexinV-FITC 混匀后,再加入5L Propidium iodide (PI ,混匀,室温避光反应15min ,1h 之内上机检测。同时染对照管和补常设置管,即未染色的裸细胞,单染AV-FITC 的管和单染PI 的管。2.7细胞线粒体膜电位检测将干预后的细胞消化重悬,收集5×105个细胞,取500L JC-1工作液将细胞混匀悬浮,37、5%CO2的培养箱中孵育20min ,离心,弃上清液,加入500L Incuba -tion Buffer 重悬细胞,于流式细胞仪进行检测分析。

11、2.8比色法分析Caspase-9和Caspase-3的活化HT-29细胞按2×105个细胞/孔,接种到6孔板中,每孔用2mL 培养液。培养24h 后,分别用不同浓度的半枝莲提取物处理,处理24h 后的细胞用裂解液在冰上放置30min ,裂解的细胞16000r /min 离心10min ,100g 的蛋白质加50L 的Asp-Glu-Val-Asp (DEVD -p-nitroaniline (pNA (caspase -3特异底物或Leu -Glu -His -Asp (LEHD -pNA (caspase-9特异底物37避光反应2h 。然后用酶标仪检测样品在405nm 的吸光度(

12、A 值。2.9统计学处理采用SPSS12.0软件进行分析,实验数据用x ±s 表示,组间比较采用单因素方差分析;P <0.05为具有显著性差异。3结果3.1ESB 对HT-29细胞增殖的影响ESB 浓度达到0.5mg /mL 对结肠癌细胞HT-29增殖有明显的抑制作用随着药物浓度的升高对HT-29的抑制率也升高,呈现剂量依赖。见图1。3.2ESB 对HT-29细胞形态的影响倒置显微镜下观察,空白组HT-29细胞胞质均匀,核仁清楚,伸展性好,生长良好,形成贴壁的梭形细胞。随着ESB 作用浓度的增加,可观察到细胞形态逐渐改变,细胞数逐渐减少,细胞多呈圆形,体积缩小,折光性差,细胞悬

13、浮、脱落而死亡。本实验结果显示ESB 能够促进HT-29细胞的凋亡,并随浓度的增加而增强,呈明显的量效趋势。见图2。3.3ESB 对HT-29细胞凋亡的影响AnnexinV 检测结果显示,HT-29细胞经ESB 干预处理后,细胞出现明显的凋亡,并随着药物浓度的增加而福建中医药大学学报第20卷36表1ESB对HT-29细胞凋亡和线粒体膜电位的影响(n=6组别实验组对照组浓度/(mg/mL0.51.52.5凋亡率/%20.65±1.74123.63±1.61152.73±4.03113.93±1.05注:与对照组比较,1P<0.01。膜电位下降率/%

14、22.68±1.551 32.68±2.231 47.89±3.6716.90±0.56图3ESB对HT-29细胞凋亡的影响注:A.对照组(0mg/mL;B.ESB(1.5mg/mL;C.ESB(2.5mg/mL。图4ESB对HT-29细胞Caspase-9活化的影响注:A.对照组(0mg/mL;B.ESB(0.5mg/mL;C.ESB(1.5mg/mL;D.ESB(2.5mg/mL。图5ESB对HT-29细胞Caspase-3活化的影响注:A.对照组(0mg/mL;B.ESB(0.5mg/mL;C.ESB(1.5mg/mL;D.ESB(2.5mg/mL

15、。增加;经1.5mg/mL、2.5mg/mL的ESB处理24h 后出现明显的DNA降解,形成阶梯状条带;JC-1检测结果显示,经ESB处理后的HT-29细胞的线粒体膜电位显著降低,呈现明显的剂量依赖。见表1、图3。3.4ESB对Caspase-9和Caspase-3活化的影响半枝莲提取物作用24h后,HT-29细胞中caspse-9及caspse-3的活化随着药物浓度的升高而增加。见图4、图5。4讨论结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势,目前手术和化疗是治疗结肠癌的主要手段,但术后化疗治疗会引起各种不良反应,而且5年生存率仍然不高,尤其是中晚期患者目前仍缺少有效的治疗方法。因此

16、,寻求新的有效的辅助防治方法和有效的治疗药物已成为肿瘤研究工作者面临的重要任务之一。而天然药物治疗各种肿瘤的副作用相对较少,所以,从天然药物中寻找有效的抗肿瘤治疗药物成为了当前肿瘤治疗研究的热点。半枝莲具有清热解毒、化瘀利尿等功效,目前广泛应用于多种肿瘤的临床治疗,并在对消化、呼吸系统的恶性肿瘤治疗中取得了较好的疗效。半枝莲含有生物碱、黄酮类甙、甾体以及酚类、鞣质等,其主要活性物质为为黄酮类化合物和二萜类化合物7。这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。故本研究应用ESB进行抗结肠癌HT-29细胞的研究。细胞凋亡在肿瘤发生发展和治疗中具有重要作用。细胞凋亡,又称细胞程序性死亡,

17、是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程;它是有一系列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的死亡过程8。其中线粒体途径在肿瘤细胞凋亡的发生过程中发挥着重要作用。研究发现,在细胞凋亡早期可观察到线粒体膜电位下降、膜通透性转变孔(permeability transition pore,PTP开放、线粒体内细胞色素C (Cytochrome C、凋亡诱导因子、钙离子等从线粒体释放入胞质,通过级联反应启动凋亡9。线粒体膜电位降低是ESB诱导细胞凋亡的条件之一,在内源性线粒体凋亡途径中,细胞内的死亡信号可以诱发线粒体释放Cyt-C。Cyt-C、AIF、Apaf-1、d

18、ATP和Caspase-9酶原结合形成凋亡复合体,第6期彭军等:半枝莲提取物诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的机制研究37Mechanism of Apoptosis of Human Colon Cancer HT-29Cells Induced by Scutellaria barbata D.Don ExtractPENG Jun,LIN Jiu-mao,WEI Li-hui,et al(Fujian Academy of Integrative Medicine,FUTCM,Fuzhou,Fujian 350108,ChinaABSTRACT:Objective To investigat

19、e the mechanism by which the extract of Scutellaria barbata D.Don (ESBinduces apoptosis of human colon carcinoma HT-29cells.Methods Human colon carcinoma HT -29cells were cultured in vitro and treated with different concentration of ESB for 24hours.Cellular morphology of HT-29cells was observed via

20、phase-contrast microscopy.The cell viability was determined by MTT assay.Cell apoptosis was detected by DNA fragmentation and flow cytometry with Annexin V staining.Mitochondrial membrane potential was examined by flow cytometry with JC-1staining.Activity of caspase 9and caspase 3was examined by col

21、orimetric assay.Results After treated by ESB,the proliferation of HT-29cells was inhibited,the cell apoptosis increased,and the mitochondrial membrane potential collapsed in a dose dependent manner.The DNA ladder bands appeared and the activity of caspase 9and caspase 3increased with the increasing

22、of ESB concentration.Conclusion Extract of ESB induces apoptosis of human colon carcinoma HT -29cells through mitochondrial pathway,and maybe it is one of the mechanism of the anti-tumor effect of ESB.KEY WORDS:Scutellaria barbata D.Don;colon cancer;HT-29;cell apoptosis;mitochondriaCaspase-9被释放并激活,接

23、着下游的Caspase-3被激活,降解底物使细胞发生凋亡10-11。本研究结果显示,ESB 能显著抑制结肠癌HT-29细胞的增殖和诱导其凋亡,呈现明显的剂量依赖。经ESB 处理的HT-29细胞明显减少,细胞变圆,由贴壁而脱落,悬浮于培养液中,Annex -inV 检测有明显凋亡,出现明显的阶梯状凋亡条带,线粒体膜电位显著降低,Caspase-9和Cas -pase-3被显著激活。均呈现明显的剂量依赖。本实验结果表明,半枝莲可通过内源性线粒体凋亡途径诱导HT-29细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。参考文献:1PETO J.Cancer epidemiology in the last century an

24、d the next decade J .Nature 2001,411(6835:390-395.2JEMAL A ,SIEGEL R ,WARD E ,et al.Cancer statistics J .CA Cancer J Clin ,2006,56(2:106-130.3CAO KJ ,MA GS ,LIU YL ,et al.Incidence of colorectal cancer in Guangzhou City from 2000to 2002J .Chin J Cancer ,2009,28(4:441-444.4YIN X ,ZHOU J ,JIE C ,et al .Anticancer activity and mecha -nism of Scutellaria barbata extract on human lung cancer cellline A549J .Life Sci ,2004,75(18:2233-2244.5叶健,徐锡坤,周建伟,等.复方