MIP-1α和血小板第4因子对造血干细胞化疗药物损伤的保护作用

1、    MIP-1和血小板第4因子对造血干细胞 化疗药物损伤的保护作用        【摘要】目的研究巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1)、血小板第4因子(PF4)及二者联合对造血干细胞化疗药物损伤的保护效应及其分子机制。方法将骨髓、脐血单个核细胞及白血病细胞株HL-60分别予MIP-1、PF4、MIP-1+PF4、PBS预处理48h，再经柔红霉素（DNR）孵育24h后，用锥虫蓝(台盼蓝)拒染法测细胞活性，用流式细胞仪测细胞周期及CD34+CD38-细胞含量，细胞集落培养

2、、免疫化学法测细胞P16、P27蛋白。结果经MIP-1及PF4预处理的骨髓和脐血单个核细胞，细胞活性、CD34CD38-细胞、集落形成能力均比对照组显著增加(P<0.05)。MIP-1、PF4组正常脐血及骨髓细胞S+G2期百分率低于对照组(P<0.05)。MIP-1可上调细胞周期调控蛋白P16表达。PF4对P16、P27表达无影响。MIP-1的保护作用强于PF4，但两者无协同效应。HL-60细胞P16、P27蛋白表达、细胞周期、细胞活性均不受MIP-1、PF4的影响。结论造血负调控因子MIP-1、PF4能可逆性、选择性地保护正常造血细胞免受化疗药损伤，MIP-1通过上调造血祖细胞G

3、1-S期调控基因p16表达，使细胞阻滞于G0期，提高细胞对周期特异性化疗药的耐受性。【关键词】干细胞因子；造血干细胞；巨噬细胞炎性蛋白1；血小板因子4；蛋白质p16；蛋白质p27 Protection of hematopoietic stem cells by MIP-1 and PF4 against the cytotoxicity of chemotherapeutic agentsHUANG Ke?, HUANG Shaoliang, PAN Jingxuan, et al.（Pediatric Department, Sun Yat-sen Memorial Hospital of

4、 Zhongshan Medical University, Guangzhou510120，China）【Abstract】ObjectiveTo study the protective effects of macrophage inflammatory protein-1(MIP-1) and platelet factor 4(PF4), alone and in combination, on hematopoietic stem/progenitor cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs. Methods

5、Bone marrow and cord blood mononuclear cells(BMMNC and CBMNC) and HL-60 cells were pretreated with MIP-1, PF4, MIP-1+ PF4,and PBS respectively for 48 hours, and then incubated with DNR for an additional 24 hours. Cell viability, cell cycle, CD34+ CD38- cells, colony forming units(CFU) and protein ex

6、pression of p16， p27 gene were measured. ResultsCell viability, the number of CD34+ CD38- cells and CFU yields of BMMNC and CBMNC in MIP-1 and PF4 groups were significantly higher than that in control groups(P<0.05). Cells in S+G2 phase in MIP-1and PF4 groups were significantly fewer than that in

7、 control groups(P<0.05). MIP-1 upregulated the expression of p16 gene of stem/progenitor cells. PF4 showed no effects on expression of both p16 and p27 genes. Hematopoietic protection of MIP-1 was stronger than that of PF4. No cooperative effect could be seen in combination of the two agents.Cell

8、 viability, cell cycle and expression of p16 and p27 gene of HL-60 cells were not affected by either MIP-1 or PF4. ConclusionMIP-1 and PF4 can reversibly and selectively protect hematopoietic stem/progenitor cells against cytotoxicity of chemotherapeutic agents. MIP-1 can suppress cell proliferation

9、 by upregulating the expression of p16 gene and block the cell cycle at G0 phase, resulting in the elevation of cell resistance to chemotherapeutic drugs.【Key word】Stem cell factor;Hematopoietic stem cell;Macrophage inflammatory protein-1；Platelet factor 4;Protein p16;Protein p27骨髓造血抑制是肿瘤患者化疗过程中常见的并

10、发症。近年来研究发现，血小板第4因子（PF4）、巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1）等造血负调控因子对骨髓造血祖细胞化疗药物损伤具有保护作用，能选择性、可逆性地阻止正常造血祖细胞于静止期，提高细胞对周期特异性药物的耐受性1，2。但是，造血负调控因子作用的分子机制目前不十分清楚。我们比较了 MIP-1、PF4单独与联合应用对骨髓造血细胞柔红霉素（DNR）损伤的保护效应及其分子机制，为其进入临床应用提供一定的理论与实验依据。材料和方法1实验材料1.1骨髓及脐血单个核细胞（MNC）悬液的制备：骨髓标本13份来自本院儿科住院患儿，其中白血病完全缓解期6例，地中海贫血1例，特发性血小板减少性紫癜2例，淋巴瘤未

11、侵犯骨髓4例。每例抽取骨髓3 ml。脐血标本10份，来自本院产房足月顺产新生儿，母婴均无疾病。每份脐血以肝素抗凝，留取脐血15ml。于24h内骨髓及脐血分别经Ficoll分离液分离有核细胞，再经RPMI 1640培养液洗涤2次，将沉淀细胞加入含体积分数为10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养液中，充分混匀，制成细胞悬液，计数有核细胞。细胞终浓度2×106/ml，细胞存活率95%以上，培养24h后备用。1.2HL-60细胞株：将复苏后的HL-60细胞（中山医科大学肿瘤研究所提供）悬浮于含体积分数为10% FCS的RPMI 1640培养液并移至培养瓶中培养，23d传代1次，细胞

12、浓度2×106/ml。细胞存活率95%以上。2实验方法实验分4组，分别为 MIP-1组加入MIP-1（美国Peprotech公司产品）100ng/ml。因其半衰期短，需每天加药、PF4组加入PF4（法国贝特公司）5g/ml、PF4+ MIP-1联合组（剂量同前）及空白对照组（仅加PBS）。HL-60细胞株作为对照组。以上各组设3个复孔，每孔含细胞数1×106ml，培养48h，每组取1孔细胞测细胞周期及P16、P27蛋白表达，剩下每孔细胞加DNR（1mg/ml）培养24h，取细胞洗涤后作活性检测、造血祖细胞集落培养及CD34+CD38-细胞含量的测定。未经因子或PBS预处理且

13、不接受DNR孵育的细胞定为预处理前细胞。2.1锥虫蓝(台盼蓝)拒染法检测细胞活性：以40g/L锥虫蓝染色细胞，30s1min后计算细胞拒染率，即为细胞存活率。2.2流式细胞仪(FACS)测CD34+CD38-细胞含量：每份样品MNC5×104，标记抗体（DaK0公司）为PE结合的CD34抗体和FITC标记的CD38抗体，对照为IgG1-PE和IgG1-FITC。根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。所用FACS为美国COULTER公司ELITE型，波长488nm。2.3体外造血祖细胞集落培养：按本室常规法3进行粒-巨噬细胞系集落形成单位（CFU-GM）及混合集落形成单位

14、（CFU-MIX）培养。第714天在倒置显微镜下计数CFU-GM，第1428天计数CFU-MIX。40个以上细胞组成的细胞团为一个集落，CFU-MIX为集落内含红细胞及巨核样细胞、粒系细胞、巨噬细胞成分。瑞氏-姬姆萨染色确定细胞类型并摄片。2.4FACS检测细胞增殖周期（S+G2）：各实验组细胞培养48h，培养液洗涤后调整细胞浓度105/ml，以体积分数为70%的乙醇固定过夜（4），FACS测出细胞各周期的DNA相对含量和百分率。2.5免疫组织化学法检测P16、P27蛋白的表达：骨髓及HL-60各组细胞经PBS洗涤，取细胞离心涂片待干燥，甲醛固定，采用ABC法（中山生物试剂公司ABC免疫试剂盒

15、，P16、P27鼠抗人单抗为美国Neomarker公司产品）进行免疫组织化学染色。两种蛋白均在细胞浆及细胞核中表达，胞浆、胞核见弥漫散在棕色颗粒为阳性表达。根据染色强度评分：无显色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。每片计数200个细胞，根据染色强度及阳性细胞数计算染色系数，对结果进行半定量。染色系数=染色强度×染色细胞百分率。3统计学分析本实验资料均以<"0102 (84 字节)" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s表示，多组间比较采用随机区组方差分析

16、（Two-way ANOVA）及多个样本均数两两比较q检验（Newman-Keuls法）。结果1MIP-1及PF4对骨髓及脐血MNC存活率的影响新鲜骨髓及脐血MNC锥虫蓝拒染率>95%。MIP-1、PF4、MIP-1+PF4组及空白对照组的骨髓、脐血MNC孵育48h后，分别加入DNR再孵育24h，结果加因子组MNC存活率均明显高于空白对照组（P值均<0.05），骨髓MNC分别为（79.0±6.0）%，（74.0±9.0)%，（79.0±6.0）%及（48.0±14.0）%，脐血MNC分别为（79.9±5.7）%，（78.2±

17、;4.7）%，（77.0±5.4）%，（59.6±8.3）%，加因子各组间差异均无显著性，MIP-1与PF4相加并无协同作用。HL-60细胞各组存活率分别为（28.0±7.0）%，（30.0±5.0）%，（25.0±6.0）%，（35.0±9.0）%，组间差异无显著性（P>0.05），均比骨髓及脐血MNC存活率低（P值均<0.05）。2MIP-1及PF4对骨髓及脐血造血细胞集落形成的影响由表1，2可见MIP-1及PF4负调控因子对造血祖细胞集落生长有明显影响，加负调控因子各组CFU-GM集落数差异无显著性，均明显少于预处理

18、前（P值均<0.05），但均明显高于空白对照组（P值均<0.05），且集落大，大多数集落含细胞数大于300个，集落维持时间长达21d以上；空白对照组大多数集落含细胞数少于100个，集落大多在第14天松散、溶解。加负调控因子各组CFU-MIX集落数同样差异无显著性，均明显少于预处理前（P值均<0.05），但均多于空白对照组（P值均<0.05），集落大，含细胞多，集落可维持28d以上；空白对照组集落小，多在第21天见松散、溶解。MIP-1组骨髓及脐血MNC的CFU-GM、CFU-MIX产率均较PF4组稍有增高，但两组比较，差异无显著性(0.05<P<0.1)。表

19、1MIP-1及PF4对骨髓造血祖细胞集落的影响（/2×106，<"0102 (84 字节)" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）组别样本数CFU-GMCFU-MIX7d14d21d14d21d28d预处理前13146.23±67.79121.51±65.2882.70±49.9922.80±10.6430.54±18.6826.60±11.12MIP-11382.23±52.86*90.9

20、0±61.96*69.23±53.78*14.36±5.45*20.31±9.18*19.69±9.38*PF41373.16±44.43*78.22±50.08*61.11±30.67*11.64±5.26*19.92±11.87*18.66±7.71*MIP-1+PF41369.12±24.66*79.27±30.79*62.33±20.12*15.18±4.94*19.12±7.78*19.30±7.99*空白对照133

21、3.25±14.43*22.60±7.53*8.10±7.13*4.64±1.63*3.50±3.12*0*     注：*与预处理前比较，P<0.05；#与空白对照组比较，P<0.05 表2MIP-1及PF4对脐血造血祖细胞集落的影响（/2×106，<"0102 (84 字节)" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）组别样本数CFU-GMCFU-MIX7d1

22、4d21d14d21d28d预处理前1075.30±13.88143.60±42.6081.40±21.5032.10±10.2645.40±11.3036.50±8.00MIP-11048.00±17.45*74.90±25.30*48.60±19.10*16.20±3.52*23.50±3.44*19.80±2.66*PF41042.70±17.45*60.70±18.48?47.20±14.51?17.30±3.27*22.90&

23、#177;5.74*19.40±4.60*MIP-1+PF41047.10±11.94*59.70±20.45*35.00±9.50*16.50±2.95*18.80±3.71*16.90±3.98*空白对照1024.90±9.40*38.90±10.20*#13.60±5.66?8.50±2.50*9.60±3.06*3.90±1.25*     注：*与预处理前比较，P<0.05；#与对照组比较，P<0.05

24、3MIP-1及PF4对骨髓及脐血CD34+CD38-细胞含量的影响CD34+CD38-细胞属重建长期造血的早期造血干/祖细胞，多处于静止期。由表3可见，骨髓MIP-1、PF4及MIP-1+PF4组的CD34+CD38-细胞分别为预处理前的72.96%、70.38%、71.94%，均有显著下降（P值均<0.05），但三组间差异无显著性，且均显著高于空白对照（P值均<0.05）。脐血CD34+CD38-细胞加因子组与处理前比较，差异无显著性。表3MIP-1及PF4对CD34+CD38-细胞的影响（<"0102 (84 字节)" src="/med/c

25、ano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）组别样本数骨髓脐血预处理前100.233±0.0790.550±0.270MIP-1100.177±0.078*0.426±0.210PF4100.164±0.076*0.377±0.123MIP-1+PF4100.169±0.066*0.397±0.127空白对照100.073±0.013*0.205±0.190*     注：*与预处理前比较，P&l

26、t;0.05；#与空白对照组比较，P<0.05 4MIP-1及PF4对细胞增殖周期的调控骨髓及脐血造血细胞MIP-1、PF4、MIP-1+PF4组的S+G2期细胞百分率均显著低于空白对照组(P均<0.05)，但联合组与单因子组比较，差异无显著性（表4）。S+G2期细胞百分率与化疗药处理后细胞存活率呈显著负相关关系（骨髓组r=-0.82，脐血组r=-0.63，P值均<0.01）。HL-60细胞各组S+G2期细胞百分率差异无显著性，均较骨髓及脐血组高。表明MIP-1、PF4将造血细胞阻止于静止期，但不影响HL-60细胞的增殖。表4MIP-1及PF4对细胞增殖周期的调控（<&

27、quot;0102 (84 字节)" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）组别S+G2期细胞比率（%）骨髓MNC脐血MNCHL-60细胞空白对照24.80±8.1011.84±3.4652.80±26.80MIP-114.08±7.13*6.04±2.70*53.73±27.50PF418.68±8.06*7.88±2.87*55.46±21.10MIP-1+PF414.32±7.93*

28、7.45±3.67*51.03±20.00     注：骨髓、脐血、HL-60细胞的样本数分别为13，10，3；*与空白对照组比较，P<0.05 5MIP-1及PF4对骨髓MNC及HL-60细胞P16、P27蛋白表达的影响由表5可见，P16、P27在骨髓MNC及HL-60细胞均有不同程度表达。骨髓MNC经MIP-1处理后P16表达高于空白对照组（P<0.05），P27表达无显著改变；经PF4处理后，P16、P27表达均无显著改变。HL-60细胞P16、P27表达不受表5MIP-1及PF4对细胞P16、P27蛋白表达的影响（

29、<"0102 (84 字节)" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）组别骨髓MNCHL-60细胞P16P27P16P27空白对照0.73±0.210.70±0.080.46±0.110.52±0.31MIP-11.02±0.15*0.72±0.090.49±0.230.60±0.22PF40.76±0.120.84±0.160.42±0.170.59±

30、0.17MIP-1+PF41.05±0.16*0.82±0.110.51±0.260.54±0.27     注：骨髓MNC、HL-60细胞的样本数分别为13，3；* 与空白对照组比较，P<0.05MIP-1、PF4的影响。 讨论DNR是细胞周期特异化疗药，对增殖期细胞有较强杀伤力，在临床化疗中呈现严重的骨髓抑制不良反应，我们选用DNR作为细胞毒试剂。结果显示，MIP-1和PF4单用或联用可明显提高正常骨髓及脐血造血细胞对DNR的耐受性，表现在细胞存活率及CD34+CD38-细胞含量、CFU-GM及CFU-M

31、IX产率均较空白对照组显著增高，且多数集落含细胞数大于300，维持时间长，表明MIP-1和PF4作用于较早期的人造血祖细胞，使静止期细胞增多，免受DNR损伤。这种保护作用是无细胞毒性的、可逆的，不损伤细胞形成集落的能力。本实验结果显示，MIP-1的保护作用强于PF4，但统计学处理后，差异无显著性(0.05<P<0.1)。联合使用MIP-1和PF4，未发现协同保护效应。MIP-1和PF4对人骨髓造血细胞保护效应的分子机制仍未完全明确。本实验结果证实两因子阻止细胞进入增殖周期，提高其对DNR的耐受性。我们分别选用作用点不同的CKI家族成员P16和P27蛋白来探讨MIP-1和PF4保护效

32、应的分子机制。16及P27主要通过阻断细胞周期中G1/S期的转换，实现对细胞周期的负调控4。实验中我们发现MIP-1及MIP-1+PF4组骨髓MNC的P16染色系数分别为1.02±0.15及1.05±0.16，均显著高于空白对照组（0.73±0.21）及PF4组(0.76±0.12)；但P27表达无明显变化。首次证实MIP-1的负调控效应是通过上调P16蛋白的表达实现的。PF4对P16、P27的表达无明显作用。Gentilini等5报告PF4对正常骨髓造血细胞的保护作用与p21基因表达有关。以上结果表明MIP-1和PF4是分别通过上调P16、P21表达，阻抑细胞进入S+G2期，从而表现对DNR杀伤的保护作用。同步实验显示，不论MIP-1和PF4处理与否，HL-60细胞S+G2期百分率、经DNR处理后细胞存活率各组间差异均无