U46619对培养的人气道平滑肌细胞增殖的作用

1、    U46619对培养的人气道平滑肌细胞增殖的作用罗雅玲文金序彭道波徐健 摘要目的和方法：研究U46619(9，11-dideoxy-11，9-epoxymethano-prostaglandin F2)对培养的人气管平滑肌细胞增殖的作用。分离人的气管平滑肌细胞并且进行传代培养。在培养基中加入各种浓度的U46619，计数细胞并且测定3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入量和三磷酸肌醇Ins(1,4,5)P3累积量。结果：U46619在一定范围内(1 nmol/L100 nmol/L)以浓度依赖的方式增加人气管平滑肌的细胞数(P0.01)。U46619

2、也增加3H-TdR的掺入量和Ins(1，4，5)P3的累积量(P0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素阻止Ins(1，4，5)P3累积量的增加（P0.01)，但对U46619的有丝分裂原的活性没有作用。结论：显示U46619刺激培养的人气管平滑肌细胞增殖。 主题词肌，平滑；增生；哮喘 Role of U46619 for proliferation of cultured human airway smooth muscle cell LUO Ya-Ling1,WEN Gin-Xu1, XU Jian2, PENG Dao-Bo1 Department of Respiratory Medicine

3、1,Renal Transplantion2,Nan Fang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou(510515) Abstract AIM：To study the role of U46619 in stimulating the proliferation of cultured human airway smooth muscle cell (ASMC).METHODS：Human ASMC were isolated and subcultured, varying concentrations of

4、U46619 were added to the media. Cell counts were obtained,3H -thymidine incorporation (3H-TdR) and inosital 1，4，5-trisphosphate Ins(1，4，5)P3 accumulation were measured.RESULTS：U46619(1 nmol/L-100 nmol/L) increased cell number in a concentration depend manner (P0.01) U46619 also increased 3H-TdR and

5、(1,4,5)P3 accumulation (P0.01). The latter response was blocked by phospholipase C inhibition with neomycin (P0.01)，however, neomycin had no effect on the promitogenic action of U46619.CONCLUSION： U46619 stimulates the proliferation of cultured human ASMC. MeSHMuscle, smooth; Hyperplasia; Asthma 血栓素

6、A2(thromboxane A2，TXA2)是花生四烯酸经环氧化酶途径代谢的主要产物之一，能强烈地收缩血管和气管平滑肌，其收缩血管的作用比血管紧张素强100倍1。TXA2性质不稳定，半衰期短。近来的研究显示：气道平滑肌的增生是引起哮喘患者气道狭窄的重要因素2。许多炎性介质如组胺、内皮素-1、白三烯D4等均能引起气管平滑肌增殖3，4，已有报道TXA2引起兔气管平滑肌增殖5。我们通过离体培养的人气管平滑肌细胞，观察TXA2稳定的类似物U46619对其增殖的作用。 材料与方法 一、标本来源： 意外事故死亡的正常人，征得家属同意，在死亡2 h之内，取靠近隆突的支气管平滑肌作实验。 二、主要试剂： U

7、46619 新霉素、消炎痛、Ham's F-12 培养基，抗平滑肌-肌动蛋白均购自Sigma公司。 三、实验方法： 1.人气管平滑肌细胞培养：无菌切下邻近隆突的气管，用Hanks液洗涤3遍，去除上皮，结缔组织、血管、软骨，用虹膜剪将气管平滑肌剪成12 mm的小块组织置于培养瓶底部，呈阵状排列。将培养瓶放入孵箱。12 h后组织块贴壁，加入含有20%胎牛血清的F-12培养基。细胞7 d开始生长，14 d达到融合。融合时用0.25%胰蛋白酶和0.04%的EDTA等量混合后消化传代，24代的气管平滑肌细胞用于实验。 2.人气管平滑肌细胞鉴定：用抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体辨认人气管平滑肌细胞。

8、3.U46619对人气管平滑肌细胞增殖的影响： (1)细胞计数：第二代人气管平滑肌细胞，以1×107细胞/L的密度接种于培养瓶中，用有血清的F-12培养24 h后，再用无血清的F-12培养24 h，使细胞同步静止于G°期，每3瓶分别加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U46619的无血清F-12培养基，另有两组分别加入1 新霉素、100 nmol/L U46619及10 mol/L消炎痛、100 nmol/L U46619的无血清F-12培养基，对照细胞单独用无血清的F-12培养，48 h后计数细胞。 (2)3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)

9、掺入试验：传代细胞以1×107细胞/L接种于24孔培养板，每孔1 mL。用无血清的F-12培养24 h后，每3孔分别加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 mol/L的U46619，或者含有1 mol/L的新霉素、100 nmol/L的U46619，或者含有10 mol/L的消炎痛，100 nmol/L的U46619的无血清F-12培养基，另外3孔作为对照组单独加入无血清的F-12。24 h后，用37×107Bq/L的3H-TdR(Amersham,放射比度1.85 GBq/mol)标记12 h，于终点常规消化，收集细胞、洗涤干燥，测每分钟放

10、射性核素闪烁记数值(countsmin-1)。 4.U46619对Ins(1，4，5)P3累积量的影响：传代细胞以1×104细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，用含有20%胎牛血清的F-12培养基孵化1周后，分别加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U466195 min，另外3瓶细胞加入1 mol/L的新霉素2 h后加入10 nmol/L的U466195 min，还有3瓶作为对照组。细胞被标准化到1×106细胞，用6%的高氯酸溶解，碳酸氢钠中和，保持在冰中1 h，离心(20 000×g，4，25 min)，后取出1 000 L上清液，用放

11、射性配基竟争结合法测定Ins(1，4，5)P3累积量(Amersham) 四、数据表达方式和统计方法： 细胞计数以细胞数/cm2及百分数表达。实验组的百分数实验组细胞计数/对照组细胞计数)×100%。3H-TdR以countsmin/L及百分数表达。实验组3H-TdR的百分数(实验组3H-TdR/对照组3H-TdR)×100%。Ins(1，4，5)P3以pmol/106细胞及百分数表达。实验组Ins(1，4，5)P3的百分数实验组Ins(1，4，5)P3/对照组Ins(1,4,5)P3×100%。 实验数据以均值±标准差()表示，用ANOVA及Stude

12、nt's test判定差异显著性。 结果 一、U46619对人气管平滑肌细胞增殖的作用： 表1可以看出U46619引起的细胞数的变化在一定范围内(1 nmol/L100 nmol/L)以浓度依赖的方式增加，以100 nmol/L的U46619引起的细胞数增长的峰值最高。磷脂酶C抑制剂1 mol/L的新霉素和环氧化酶抑制剂10 mol/L消炎痛对于100 nmol/L的U46619引起的细胞数增长没有抑制作用。 表1U46619对培养的人气管平滑肌细胞增殖的作用 Tab 1The effect of U46619 on cultured airway smooth muscle cell

13、 (ASMC) proliferation (，n=3) Group Concentration (nmol/L) ASMC count (cell/cm2) Proliferation (% control) Control No stimulation 1990±1650 U46619 1 21600±700* 108.71±3.53 10 23500±780* 117.90±3.89 100 29300±850* 147.07±4.28 1000 22000±820* 110.56±4.11 U46

14、619+neomycin 1001×103 29000±1970* 145.90±9.92 U46619+indomethacin 10010×103 29700±3100* 149.08±15.52 *P0.01，vs control 二、U46619对人气管平滑肌细胞3H-TdR结合的影响： 表2可见U46619引起的3H-TdR结合在一定范围内(1 nmol/L100 nmol/L)呈剂量依赖性增长，以100 nmol/L的U46619引起的3H-TdR增加的峰值最高。磷脂酶C抑制剂1 mol/L的新霉素的和环氧化酶抑制剂10

15、mol/L的消炎痛对于100 nmol/L的U46619引起的3H-TdR的增加没有抑制作用。 表2U46619对培养的人气管平滑肌细胞3H-胸腺嘧啶 核苷结合的作用 Tab 2The effect of U46619 on 3H-Thymidine(3H-TdR) incorporation in cultured human ASMC (，n=3) Group Concentration (nmol/L) 3H-TdR (×103 counts.min-1/L) Proliferation (% control) Control 11810±1013 U46619 1

16、13984±1603* 118.41±13.57 10 15040±1319* 127.35±11.17 100 18316±890* 155.09±7.54 1 000 13340±900* 112.96±7.62 U46619+neomycin 1001×103 18146±1894* 153.65±16.04 U46619+indomethacin 10 010×103 18494±724* 156.46±5.89 *P0.01，vs control

17、 三、U46619对人气管平滑肌细胞Ins(1，4，5)P3累积的影响： 表3可见U46619可引起Ins(1，4，5)P3累积的增加。其中以10 nmol/L的U46619引起细胞Ins(1，4，5)P3累积量最高。1 mol/L的新霉素对10 nmol/L的U46619引起的Ins(1，4，5)P3累积量的增加有一定的抑制作用(P0.01)。 表3U45519对培养的人气管平滑肌细胞三磷酸肌醇累积量的作用 Tab 3The effect of U46619 on inositol 1，4，5-trisphosphate Ins(1，4，5)P3accumulation in culture

18、d human ASMC(，n=3) Group Concentration (nmol/L) Ins(1,4,5)P3 (cell/cm2) Proliferation (% control) Control 11.94±1.19 U46619 1 25.19±1.86* 210.97±15.61 10 39.91±2.19* 334.23±18.37 100 19.87±2.08* 166.47±17.43 U46619+neomycin 101 000 21.30±1.93* 178.42±16.1

19、5 *P0.01，vs control 讨论 血栓素A2在肺内的主要生物学活性是引起血管和气管平滑肌收缩，同时参加气道高反应性的发生6。我们的研究证实血栓素A2的类似物U46619能刺激人的气管平滑肌细胞增殖。它能增加体外培养的人气管平滑肌的细胞数，增加3H-TdR结合量和Ins(1，4，5)P3累积量。过去10年，人们对哮喘发病机理和病理生理学基础的认识产生了一个巨大的飞跃。认识到哮喘是气道的一种非特异性炎症。以嗜酸性粒细胞和肥大细胞为主要作用细胞。病理改变是上皮剥脱、粘膜水肿，炎症细胞浸润，微血管渗漏等7。人们把研究的目光都集中在气道炎症方面。但是近来发现以吸入表面激素为主的抗炎治疗不能根

20、治哮喘。实际上哮喘患者的气道壁发生了不同程度的增殖，使管壁增厚，管腔变窄8，气道发生了重塑。根据Bramley等的假设进行计算9，平滑肌的肥大或增生有可能是哮喘产生气道阻塞的主要作用因素。因此，哮喘气管壁的重塑的结构改变引起了功能的改变，对于研究哮喘的病理生理学改变和临床防治提供了一个新方向10。 作者单位:罗雅玲文金序彭道波第一军医大学南方医院呼吸科 徐健肾移植科(广州510515) 参考文献 1MaJerus PW. Antithrombotic therapy. Drug Therapy, 1983,10:51. 2Hirst SJ, Twort CHC. The proliferati

21、ve response of airway smooth muscle. Clin Exp Allergy, 1992,22:907. 3Noveral JP, Rosenberg SM, Anbar RA, et al.Role of endothelin-1 in regulating proliferation of cultured rabbit airway smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992,263:L317. 4Wang CG, Du T, XuL J, et al. Role of leukotriene D4 in allergen induced in creases in smooth muscle in the rat. Am Rev Respir Dis,1993, 148:413. 5Noveral JP, Michael MG. Role and mechanism of thromboxane-induced proliferation of cultured airway smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992,263:L555