TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变

1、TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变                       作者：孙雪梅, 徐祖琼, 于慧, 赖仁胜, 谢玲, 顾香芳,夏珺, 李建勇【摘要】  目的: 采用不同方法检测慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）患者的JAK2V617F突变率, 评估临床应用的可能性。方法: 提取84例Ph阴性CMPD患者单个核细胞DNA,

2、 利用Real time PCR联合TaqmanMGB探针检测骨髓增殖性疾病患者的JAK2V6A7F的发生率, 并利用限制性片段长度多态性（RFLP）对照检测CMPD患者的JAK2V617F突变率, 用基因测序验证两种结果。结果: Real time PCR联合TaqmanMGB探针检测84例Ph（-）CMPD患者, 42例存在JAK2V617F, 突变率为50%; 其中PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%（23/30）、25.9%（7/27）、42.5%（9/20）, 经RFLP检测84例Ph（-）CMPD总的突变率为33.3%, 测序结果验证了Real time PCR联合Taq

3、manMGB探针检测结果。结论: TaqmanMGB探针联合Real time PCR方法有较高的准确率, 可以作为检测JAK2V617F突变的方法。 【关键词】  慢性骨髓增殖性疾病; JAK2突变; 检测方法慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）是以骨髓过度增殖为特点的一类疾病,  Ph阴性CMPD包括真性红细胞增多症（PV）、慢性特发性骨髓纤维化（CIMF）、原发性血小板增多症（ET）、不能分类的骨髓增殖性疾病（CMPDU）和慢性嗜酸性粒细胞白血病（CEL/HES）等。2005年开始多个研究小组发现Ph阴性CMPD患者中存在JAK2V617F突变1, 2, 功能研究以及模式动

4、物研究显示该突变可引起JAK2激酶及下游信号通路的持续活化, 导致细胞恶性增殖和凋亡抑制3。最新的WHO诊断标准强调了JAK2V617F突变的重要性, JAK2V617F应用于临床诊断要求有简便而灵敏的检测方法4。TaqmanMGB探针是一种新型检测单核苷酸多态性的探针, 我们利用这种探针联合Real time PCR方法5检测CMPD患者的JAK2V617F突变率, 并与限制性片段长度多态性以及基因测序相比较, 以寻找一种方便快捷的检测手段。1  材料和方法1.1  材料 84例Ph阴性CMPD患者, 中位年龄51岁, 其中PV 30例, ET 27例, IMF

5、 20例, CMPDU 7例, 其中男47例, 女37例, 6例骨髓移植供者作为正常对照, 中位年龄为32岁, 男3例, 女3例。诊断标准符合2001年WHO标准6。1.2.1  样本收集和单个核细胞分离 患者外周血或者骨髓经肝素抗凝后收集, 外周血经上臂静脉、骨髓经髂前上棘或髂后上棘采集。利用人淋巴细胞分离液分离外周血/骨髓单个核细胞。1.2.2  JAK2V617F突变检测 提取单个核细胞DNA, 保存于-20; 利用紫外分光光度计检测DNA浓度; 利用Real time PCR联合TaqmanMGB探针检测样本JAK2V617F突变: MGB探针:

6、 FAMCCACAGACACATACT MGB ; TETCCACAGAAACATACTCMGB;Taq引物:FP:5TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAAG3;  RP:5GCAGCAAGTATGATGAGCAAGC3; 按下列体系加样（20 L体系）: 2×HoTaq PCR Reaction Mix 10 L, 探针mix（10 mol/L）0.6 L, 引物mix（20 mol/L）0.5 L, 模板（25 mg/L）2 L, ddH2O水6.7 L。反应条件: 2 min 50、10 min 95, 30 s 95, 34 s 62, 50个循环。利用Ap

7、plied Biosysterm软件观察结果。限制性片段长度多态性检测JAK2V617F突变: 利用引物F: 5GGGTTTCCTCAGAAC GTTGA3; R:5TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA3经PCR扩增样本DNA, 扩增出的DNA片段经提纯后利用Bsa酶酶切, 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。比较上述两种方法检测的结果, 将结果不同的样本DNA经PCR扩增后送基因测序。1.2.3  统计学分析 使用SPSS10.0软件, 利用配对卡方检验以及Kappa检验, 比较两种检测手段的检出率。2  结果2.1  TaqmanMGB探针联合Rea

8、l time PCR检测结果 84例PhCMPD患者中有42例患者有突变, 突变率为50%。其中30例PV患者中有23例患者有突变, 其中两例为纯和突变, 其余21例为杂合突变, 突变率为76.7（23/30）; 27例ET患者中有7例患者有突变, 均为杂合突变, 阳性率为25.9（7/27）; 其余患者无突变。20例IMF患者中有9例患者有突变, 均为杂合突变, 突变率为42.5（9/20）, 其余患者无突变。7例CMPDU中有3例有突变, 均为杂合突变（3/7）, 其余患者无突变。6例骨髓移植供者均无突变(图1)。2.2  限制性片段长度多态性检测JAK2V617F突变

9、结果  84例Ph阴性CMPD患者中有28例患者检测到JAK2V617F突变（33.3%）, 其中30例PV患者中有16例有JAK2V617F突变, 即53.3%（16/33）, 27例ET患者中有5例有突变, 突变率为14.8%（5/27）; 20例IMF患者中有5例有突变, 突变率为25%（5/20）, 7例CMPDU中2例有突变（2/7）,  6例骨髓移植供者均无突变。2.3  测序结果  84例患者中有18例患者检测结果不一致, 其中16例为经Real time PCR检测到有JAK2V617F突变, 但经RFLP方法未检测出突变, 2例经RFL

10、P方法检测有突变但经Real time PCR检测提示无突变, 将这18例样本重新扩增后送测序, 并将2例纯合突变样本也扩增后基因测序。16例Real time PCR检测为有JAK2V617F突变的患者, 经测序也提示有JAK2V617F突变, 但均为杂合突变, 野生的碱基G的荧光强度高于突变的碱基T的荧光强度, 与相应样本的的Realtime PCR检测中荧光强度一致; 2例经RFLP检测提示有突变患者, 经测序后提示无JAK2V617F突变(图2)。1         3 讨论  

11、0;  国外研究组报道JAK2V617F突变在 PV中发生率为65%97%, ET为23%57%, IMF为35%50%; 我们利用Real time PCR 检测的PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%（23/30）、25.9%（7/27）、42.5%（9/20）。获得性突变使jak2基因编码的蛋白质第617个氨基酸从缬氨酸转化为苯丙氨酸, 使JAK2介导的包括促红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、白细胞介素3（IL3）、生长因子（GH）在内的多种细胞因子的信号转导在没有信号刺激下能持续激活, 引起细胞持续增殖, 这是骨

12、髓增殖性疾病发生的重要环节。    目前, 用于JAK2突变的研究与临床检测方法众多7, 我们采用的TaqmanMGB探针是联合传统的Taqman以及MGB探针组成的新型探针, 是单核苷酸多态性的检测中常用的探针, MGB探针可以结合在DNA 双螺旋的小沟里, 从而起到稳定DNA双螺旋的作用5, 使探针更加稳定以及更具特异性, 实验中所用的MGB探针因其长度较短, 使淬灭分子与报告基团在空间位置上更接近, 使实验的结果更精确, 另外由于探针3端结合了MGB , 使得探针的Tm 值提高, 大大增加了探针的杂交稳定性, 提高了配对与非配对模板间的Tm 值差异, 使非特

13、异性杂交显著降低。我们检测的总的检测率（50%）高于限制性片段长度多态性的检出率（33.3%）, 而且与测序结果一致, 检出率较高。国内阮氏8曾用同样的方法检测了MPD患者JAK2V617F突变, 其中76例PV、115例ET和19例MF患者JAK2V617F突变的检出率分别为70、51及58; 而在其他恶性血液病及16例正常供者骨髓细胞中的检出率均为0。认为JAK2V617F突变在我国MPD患者中是广泛存在的。利用TaqManMGB探针进行实时定量PCR的方法可快速、准确地检测JAK2V617F突变。Elizabeth利用Real time PCR方法检测CMPD患者的JAK2V617F突变

14、率为39%, 可以在含有含2.5%突变的DNA中检测到突变9, Poodt也利用Real time PCR方法但使用的探针为MGB探针, 可以在含有0.8%的突变的DNA中检测出突变, 敏感度比其他实验组所用的方法高10。我们利用TaqmanMGB探针联合Real time PCR方法我们检测的总的检出率（50%）高于限制性片段长度多态性的检出率（33.3%）, 而且与测序结果一致, 检出率较高。而且此方法所需实验步骤少, 减少了污染发生的可能。另外Real time PCR可以进行定量检测, 为患者临床随访提供监测手段, 为疾病的发生以及发病机制的研究提供平台。【】  1Baxte

15、r EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disordersJ. Lancet, 2005, 365（9464）: 1054-1061.2Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and my

16、eloid metaplasia with myelofibrosisJ. Cancer Cell, 2005, 7（4）: 387-397.3Wernig G, Mercher T, Okabe R,et al. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia veralike disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant modelJ. Blood, 2006, 107（11）: 4274-4281.4Tefferi A, Vardiman JW.

17、 Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and pointofcare diagnostic algorithmsJ. Leukemia, 2008, 22(1): 14-22.5Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, et al. 3Minor groove binderDNA probes increase sequence specificity at PCR extension temp

18、eraturesJ. Nucleic Acids Res, 2000, 28（2）: 655-661.6Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasmsJ. Blood, 2002, 100(7): 2292-2302.7徐祖琼, 孙雪梅. Ph（-）慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F检测技术及临床应用的进展J. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24（11）: 1123-1125.8阮国瑞, 陈珊珊, 李玲娣, 等. TaqManMGB探针检测骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变J. 中华医学杂志, 2007, 87(34): 2401-2404.9Elizabeth CW, Katy H, Lorna WH, et al. Development of a quantitat