分子医学实验绪论ppt课件

1、实验室规那么实验室规那么 一坚持实验室安静，仔细仔细地按实验指点一坚持实验室安静，仔细仔细地按实验指点进展实验。进展实验。二穿戴好实验服。坚持实验台的清洁整齐。二穿戴好实验服。坚持实验台的清洁整齐。三维护仪器，谨慎运用。节约运用药品试剂，三维护仪器，谨慎运用。节约运用药品试剂，蒸馏水，自来水和电。蒸馏水，自来水和电。 四不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛四不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。洒在实验台上。 五公用物品用毕放回原处，不得私自占有。五公用物品用毕放回原处，不得私自占有。 六取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕六取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。放回原处。

2、 七加热、用电，运用剧毒腐蚀试剂应留意平七加热、用电，运用剧毒腐蚀试剂应留意平安操作，防止事故。安操作，防止事故。 八废弃液体除指定有专门容器搜集者外，应八废弃液体除指定有专门容器搜集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。动物尸体应放入指定的容器中。动物尸体应放入指定的容器中。 九实验过程中本人不能处理或决议的问题，九实验过程中本人不能处理或决议的问题，切勿盲目处置，应及时向指点教师反映获得协助。切勿盲目处置，应及时向指点教师反映获得协助。 十实验终了，须将试剂陈列整齐，整理好公十实验终了，须将试剂陈列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收

3、起。檫净实验台，请指点用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指点教师检查，允许后方可分开。教师检查，允许后方可分开。成果评分规范成果评分规范 50% 实验实验 + 50%实际考试实际考试实验课实验课8次，实验报告，实验表现包括迟次，实验报告，实验表现包括迟到早退，着装规范，实验操作规范，实验室到早退，着装规范，实验操作规范，实验室卫生值日等，卫生值日等，8次实验总分最后按比例计入次实验总分最后按比例计入总成果。总成果。实验报告存档，不需归还学生。实验报告存档，不需归还学生。实际考试内容来自于讲义及平常教学实际考试内容来自于讲义及平常教学 第八次设计性实验课安排第八次设计性实验课安排 分组方案：

4、分组方案：4人一组无法组队同窗参与其人一组无法组队同窗参与其它组它组 争辩争辩ppt内容：内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，实验目的，意义，原理，实验方法选择，估计结果及数据表现方式，实验难点及能估计结果及数据表现方式，实验难点及能够出现问题，能够出现的实验结果偏向及够出现问题，能够出现的实验结果偏向及解释解释 争辩安排：争辩安排： 第五周将争辩第五周将争辩ppt电子版本给教师，争辩日电子版本给教师，争辩日每组时间控制为每组时间控制为20分钟演讲，分钟演讲，10分钟提问分钟提问 设计性实验标题：设计性实验标题： 1 免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的分别纯化与鉴定。的分别纯化与鉴定。 2

5、人血洁白蛋白的提取纯化及分子量的测定。人血洁白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分别鉴定。蛋清中溶菌酶的分别鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分别纯化及酶动力学研讨。小鼠肝脏过氧化氢酶的分别纯化及酶动力学研讨。 5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为资料设计实验检测羧肽酶腺和肝脏为资料设计实验检测羧肽酶A1酶原酶原(procarboxypept

6、idase A1)和白蛋白和白蛋白(Albumin)并计算这并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 8 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶Cytochrome oxidase在肝脏中有在肝脏中有三种亚型，即细胞色素氧化酶三种亚型，即细胞色素氧化酶1，2和和3，请以实验小鼠肝，请以实验小鼠肝脏为资料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达脏为资料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达量。量。 生物化学生物化学 运用化学的原理和方法，研运用化学的原理和方法，研讨生命景象、生命的本质、生命活动及其规律讨生命景象、生命的本质、生命活动及其规律的的学科。的的学科。

7、医学生物化学医学生物化学 研讨人体的化学组成、研讨人体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信息传送、生物分代谢、营养、酶功能、遗传信息传送、生物分子的相互作用等以及疾病的分子机制。子的相互作用等以及疾病的分子机制。经过研讨，不仅从分子程度阐明生命景象及经过研讨，不仅从分子程度阐明生命景象及疾病分子机制，同时也可以为疾病的诊断及治疾病分子机制，同时也可以为疾病的诊断及治疗提供有效的措施。疗提供有效的措施。 医学分子生物学医学分子生物学 从分子程度研讨人体从分子程度研讨人体在正常和疾病形状下生命活动及其规律的一在正常和疾病形状下生命活动及其规律的一门科学。门科学。它主要研讨人体生物大分子包括蛋白质

8、和核它主要研讨人体生物大分子包括蛋白质和核酸的构造、功能、相互作用及其与疾病发生、酸的构造、功能、相互作用及其与疾病发生、开展的关系。开展的关系。分子生物学的根底实际和特有的研讨技术体分子生物学的根底实际和特有的研讨技术体系是分子生物学学科的重要特征，在疾病诊系是分子生物学学科的重要特征，在疾病诊断及治疗中具有重要的运用价值。断及治疗中具有重要的运用价值。 医学遗传学医学遗传学 运用遗传学的实际与方运用遗传学的实际与方法研讨遗传要素在疾病的发生、流行、诊断、法研讨遗传要素在疾病的发生、流行、诊断、预防、治疗和遗传咨询等的作用机制及其规预防、治疗和遗传咨询等的作用机制及其规律的遗传学分支学科。律

9、的遗传学分支学科。内容包括遗传的细胞和分子根底、人类染内容包括遗传的细胞和分子根底、人类染色体与染色体病、单基因遗传病、多基因遗色体与染色体病、单基因遗传病、多基因遗传病、生化遗传病、线粒体基因病、肿瘤遗传病、生化遗传病、线粒体基因病、肿瘤遗传、遗传病的诊断和产前诊断等以及染色体传、遗传病的诊断和产前诊断等以及染色体制备和基因检测实验指点等。制备和基因检测实验指点等。 生物化学是分子生物学的根底，分子生物学是生物化学的延伸和生物化学是分子生物学的根底，分子生物学是生物化学的延伸和开展，遗传学那么是生物化学与分子生物学研讨的临床学意义的直接表开展，遗传学那么是生物化学与分子生物学研讨的临床学意义

10、的直接表达，三门学科的关系可用以下图予以概括：达，三门学科的关系可用以下图予以概括： 、，在学科开展上，在学科开展上及实验技术上相互依赖的及实验技术上相互依赖的三门课程。三门课程。 目的：培育学生掌握最根本的实验室目的：培育学生掌握最根本的实验室技术与技艺，包括提取生物大分子的方法、技术与技艺，包括提取生物大分子的方法、定量测定方法及提取效果的检测。定量测定方法及提取效果的检测。 包括：动物组织中蛋白质的提取、常包括：动物组织中蛋白质的提取、常用蛋白质定量方法、蛋白质电泳的根本方用蛋白质定量方法、蛋白质电泳的根本方法、动物组织法、动物组织DNA的提取、的提取、DNA测定方法、测定方法、DNA电

11、泳的根本方法、染色体标本制备技电泳的根本方法、染色体标本制备技术、各种层析技术的原理及根本操作方法。术、各种层析技术的原理及根本操作方法。 目的：除了运用根本技艺训练部分的实目的：除了运用根本技艺训练部分的实验技术，本类别实验还将学习验技术，本类别实验还将学习PCR技术、技术、蛋白印迹技术、人类外周血染色体标本制蛋白印迹技术、人类外周血染色体标本制备及核型分析等。备及核型分析等。同时亲密结合临床问题，有针对性训练学同时亲密结合临床问题，有针对性训练学生从事临床研讨的思绪及掌握自行设计实生从事临床研讨的思绪及掌握自行设计实验的根本知识。验的根本知识。 包括：人类外周血染色体标本的制备包括：人类外

12、周血染色体标本的制备及核型分析；及核型分析；DMD基因突变检测；综合实基因突变检测；综合实验设计。验设计。 目的：现代医学的开展与多种新技术的目的：现代医学的开展与多种新技术的开展与建立是亲密相关的，由于本科实验教开展与建立是亲密相关的，由于本科实验教学能掌握的技术有限，因此设置了经过实际学能掌握的技术有限，因此设置了经过实际教学与视频观摩相结合的课程来了解蛋白质教学与视频观摩相结合的课程来了解蛋白质组学技术、基因芯片技术、基于序列捕获技组学技术、基因芯片技术、基于序列捕获技术的二代测序技术及它们的临床运用。术的二代测序技术及它们的临床运用。 经过本实验课程教学到达目的：经过本实验课程教学到达

13、目的： 实验操作、新实验操作、新技术引见、视技术引见、视频观摩合理交频观摩合理交叉安排，便于叉安排，便于有效利用时间。有效利用时间。p 生物样本中蛋白质的提取和含量测定生物样本中蛋白质的提取和含量测定p SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量测定蛋白质相对分子质量p 基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术p 层析技术凝胶过滤，离子交换，薄层层析，层析技术凝胶过滤，离子交换，薄层层析，HPLCp 真核生物基因组真核生物基因组DNA提取、含量和纯度测定提取、含量和纯度测定p 人外周血染色体标本制备、人外周血染色体标本制备、DMD基因突变检测基因突变检测p

14、染色体染色体G分带和核型分析及遗传病基因突变分析分带和核型分析及遗传病基因突变分析p 设计性实验工程设计性实验工程八周实验课的内容安排八周实验课的内容安排总体实验安排总体实验安排8个个 实验各有长短，个别实验能够会实验各有长短，个别实验能够会超时，但总时间大致不变超时，但总时间大致不变实验报告实验报告 实验终了后，应及时整理和总结实验结果及记录，实验终了后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照以下顺序写出实验报告：按照以下顺序写出实验报告： 实验报告首页：实验称号实验报告首页：实验称号The title of experiment ；姓名；学号；班级；组别；同；姓名；学号；班级；组别；同组同窗

15、；带教教师；实验日期等。组同窗；带教教师；实验日期等。 正文：原理正文：原理Principle；操作步骤；操作步骤Operational procedure；实验结果；实验结果Results：包括照片、原始数据、计算过程：包括照片、原始数据、计算过程及图表等；讨论及图表等；讨论Discussion：对实验方法，：对实验方法，实验结果和异常景象进展讨论和评论，以及对于实验结果和异常景象进展讨论和评论，以及对于实验设计的认识、领会和建议。实验设计的认识、领会和建议。动物细胞蛋白质的提取和含量测定动物细胞蛋白质的提取和含量测定 蛋白质是生命景象的物质根底之一，是生蛋白质是生命景象的物质根底之一，是生

16、物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的构造与功能研讨，是生命科学的中心问的构造与功能研讨，是生命科学的中心问题。题。 要研讨蛋白质的构造与功能，往往从细胞要研讨蛋白质的构造与功能，往往从细胞中提取蛋白质开场，而对蛋白质含量的测中提取蛋白质开场，而对蛋白质含量的测定那么是蛋白质相关研讨中的必备技术。定那么是蛋白质相关研讨中的必备技术。根本原理根本原理 动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验资料。实验选用小鼠肝脏细胞作为实验资料。 采用匀浆法将其破碎，然后参与样品提取采用匀浆法将其破碎，然后参与样品提

17、取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。搜集上清液后可进展蛋白质定量分碎片。搜集上清液后可进展蛋白质定量分析。析。 蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。白质发生变性和被蛋白酶降解。 根本的防备措施是尽能够缩短提取时根本的防备措施是尽能够缩短提取时间和在尽能够低的温度下进展提取。间和在尽能够低的温度下进展提取。 为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中参为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中参与蛋白酶抑制剂。与蛋白酶抑制剂。 例如参与苯甲磺酰氟例如参与苯甲磺酰氟PMSFPMSF可以抑制丝可以抑制丝氨酸蛋白酶和某

18、些半胱氨酸蛋白酶；氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶； 胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶； 乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸EDTAEDTA可抑制金属蛋白酶。可抑制金属蛋白酶。 为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可参与为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可参与一定量的复原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。一定量的复原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。 思索到溶液中如存在重金属离子如铝、思索到溶液中如存在重金属离子如铝、铜、铁离子能够会与蛋白质构成不溶复铜、铁离子能够会与蛋白质构成不溶复合物，可在溶液中参与一定浓度的合物，可在溶液中参与一定浓度的EDTAEDTA。 目前蛋白质的含量测定常用的方法有定

19、氮目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法法、双缩尿法Biuret法、法、Folin酚试酚试剂法剂法Lowry法、考马斯亮蓝法法、考马斯亮蓝法Bradford法、法、BCA法和紫外吸收法。法和紫外吸收法。 其中其中Bradford法和法和Lowry法灵敏度较高，法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏比紫外吸收法灵敏1020倍，比倍，比Biuret法法灵敏灵敏100倍。倍。 上述这些方法并不能在任何条件下适用于上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何方式的蛋白质，由于一种蛋白质溶液任何方式的蛋白质，由于一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有能够得出几种不同用这几种方法测定，有能够得出几种不同的结果。

20、每种测定法都不是完美无缺的，的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺陷。都有其优缺陷。 在选择方法时应思索：实验对测定所要在选择方法时应思索：实验对测定所要求的灵敏度和准确度；蛋白质的性质；求的灵敏度和准确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要破溶液中存在的干扰物质；测定所要破费的时间。费的时间。 Lowry法：法： 该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合构成复杂的络碱性溶液中能与铜离子结合构成复杂的络合物类似双缩脲反响。合物类似双缩脲反响。 由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条

21、件下进而与碱性条件下进而与Folin酚试剂构成蓝色酚试剂构成蓝色复合物。复合物。 上述呈色反响色泽深浅皆与蛋白质含量成上述呈色反响色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此经过比色，参照知含量的规范正比。因此经过比色，参照知含量的规范蛋白质的比色规范曲线，可确定待测样品蛋白质的比色规范曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。的蛋白质含量。 考马斯亮兰法：考马斯亮兰法： 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。色。 染料主要是与蛋白

22、质中的碱性氨基酸特染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复蛋白质复合物在合物在595 nm下，吸光度与蛋白质含量呈下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。 紫外吸收法测定蛋白质浓度：紫外吸收法测定蛋白质浓度： 蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大这两种芳香族氨基酸分子中含有大键，它键，它们在们在280 nm紫外光附近有光吸收。紫外光附近有光

23、吸收。 因此使蛋白质在上述紫外波长附近产生较因此使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进展含量测定。其进展含量测定。操作步骤操作步骤 1用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完好肝脏，用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完好肝脏，小心去掉胆囊不要弄破，放入盛冷生理盐水的小心去掉胆囊不要弄破，放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。烧杯中漂洗干净。2取小鼠肝组织取小鼠肝组织0.5 g，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。浆管中。3按按1：15的比例往玻璃匀浆管中参与匀浆缓冲液的比例往玻璃匀浆管中参与匀浆缓冲液即每份

24、样品需加预冷的提取缓冲液即每份样品需加预冷的提取缓冲液7.3mL，蛋白，蛋白酶抑制剂酶抑制剂0.2 mL，手动匀浆。留意用力均匀，以，手动匀浆。留意用力均匀，以免损坏匀浆管。免损坏匀浆管。4匀浆完成后，取两只匀浆完成后，取两只1.5 mL eppendorf管，各参管，各参与与1.2 mL匀浆液后，置入冷冻离心机中。匀浆液后，置入冷冻离心机中。 5于于4，13000 rpm离心离心20分钟后，小心取出上清分钟后，小心取出上清液至液至1.5 mL eppendorf管中，上清液需低温保管，管中，上清液需低温保管，作为待测样品备用。作为待测样品备用。Lowry法法 1取取16 mm*150 mm试

25、管试管16支，标明号支，标明号码，放置在试管架，在码，放置在试管架，在16号试管内分别号试管内分别参与规范牛血洁白蛋白运用时取贮液用参与规范牛血洁白蛋白运用时取贮液用双蒸水稀释至双蒸水稀释至0.5 mg/mL0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用双蒸水补足至每管，用双蒸水补足至每管总体积总体积0.5 mL，在，在7、8号试管内分别参与号试管内分别参与待测样品待测样品25、50 L，并用双蒸水补足至，并用双蒸水补足至0.5 mL即将待测样品稀释即将待测样品稀释20或或10倍。倍。916号反复号反复18号。号。 2各管参与各管参与2.5 mL新配制的碱性铜溶液，新配制的碱性铜溶液，立

26、刻摇匀，在室温下放置立刻摇匀，在室温下放置10min。 3各管参与各管参与0.5 mL Folin酚试剂运用液，酚试剂运用液，边参与边立刻充分混合用震荡混合器，边参与边立刻充分混合用震荡混合器，然后在室温下放置然后在室温下放置3060min不要超越不要超越60min。 4将规范样品及待测样品在可见光光度计将规范样品及待测样品在可见光光度计上在上在550 nm波长下比色。波长下比色。 5根据知含量的规范样品测得的吸光度做根据知含量的规范样品测得的吸光度做规范曲线，然后根据待测样品的吸光度在规范曲线，然后根据待测样品的吸光度在规范曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释规范曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释

27、倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。考马斯亮兰法测定蛋白质浓度考马斯亮兰法测定蛋白质浓度 1取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号支，标明号码，放置在试管架，在码，放置在试管架，在16号试管内分别号试管内分别参与规范牛血洁白蛋白运用时取贮液用参与规范牛血洁白蛋白运用时取贮液用双蒸水稀释至双蒸水稀释至0.5 mg/mL0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用双蒸水补足至每，用双蒸水补足至每管总体积管总体积0.1 mL，在，在7、8号试管内分别参号试管内分别参与稀释与稀释20、10倍的待测样品倍的待测样品0.1 mL。916号反复号反复18号。号。 2每管参与考马斯亮兰每管参与考马斯亮兰G250染料试剂染料试剂3 mL, 摇匀，室温静置摇匀，室温静置3分钟。分钟。 3分光光度计于波长分光光度计于波长595nm比色。比色。 4根据知含量的规范样品测得的吸光度做根据知含量的规范样品测得的吸光度做规范曲线，然后根据待测样品的吸光度在规范曲线，然后根据待测样品的吸光度在规范曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释规范曲线上查出其蛋