蛋白质含量的测定

1、蛋白质含量的测定一、目的 1、了解Folin-酚试剂法和考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的基本原理和干扰因素；2、掌握标准曲线的制作方法和样品中蛋白质含量的计算方法；3、准确掌握72型分光光度计的使用方法。二、原理1、Folin-酚试剂法：本方法所用的试剂由两部分组成。试剂甲为碱性溶液，可与蛋白质形成铜-蛋白质复合物，试剂乙在碱性条件下极不稳定，易被此复合物（酚羟基和亚铜离子）还原成蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比，此法的检测浓度范围为25-250g/ml。2、考马斯亮蓝G-250法：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（

2、max）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，其在1100g/ml蛋白质浓度范围内成正比。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定消光值A595，与蛋白质浓度成正比。 三、实验器材和试剂1、试剂：（1）标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清清蛋白，配制成250g/ml的标准蛋白溶液溶液（ Folin-酚试剂法用）； 100g/ml标准蛋白质溶液（考马斯亮蓝G-250 法用）。（2）考马斯亮蓝G-250试剂 （3）Folin-酚试剂的配制（均用分析纯试剂）：试剂甲：由下述四种溶液配制的。（1）4%碳酸钠（Na2C

3、O3）溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠溶液；（3）1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液；（4）2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配成碳酸钠-氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Folin-酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。试剂乙（Folin氏试剂）：在2 L的磨口迴流装置内加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），700ml蒸馏水，再加50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸，充分混合后，以小

4、火迴流10h。再加入150g硫酸锂（LiSO4），50ml蒸馏水及数滴液体溴。然后开口继续沸腾15min，以便驱除过量的溴。冷却后定容到1 L。过滤，滤液微呈绿色，置于棕色试剂瓶中冰箱保存。使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，以酚酞为指示剂，而后适当稀释（约1倍），使最后浓度为1mol/L酸性溶液，此为Folin-酚试剂乙应用液。贮于冰箱中可长期保存。2、仪器：分光光度计，试管，吸管，玻璃棒，电子天平，离心机，微量移液枪（1ml）等 四、操作步骤1、样品制备：称取小白菜叶片2g，用研钵匀浆，加入3ml蒸馏水，继续研磨至无大颗粒存在，再用蒸馏水将其转入离心管中，使加入水总量为15ml。离心管平衡后20

5、00r/min离心10min，取上清液1ml，分别稀释20倍和40倍备用。 2、标准曲线的制作与样品测定（1）Folin法标准曲线（ml）稀释20倍样品液（ml）管号12345678910标准蛋白00.10.20.40.60.81.0样品液1.01.01.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.20000Folin-酚试剂甲2.52.52.52.52.52.52.52.52.52.5充分混匀，室温放置10minFolin-酚试剂乙每管加入试剂乙0.25ml，充分混匀各管与30水浴锅中水浴30分钟，于分光光度计上测A650nm值A650nm（2）考马斯亮蓝法 标准曲线（ml）稀释40倍样品液管

6、号12345678910标准蛋白00.10.20.40.60.81.0待测样品液1.01.01.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.20000考马斯亮蓝G-2502.52.52.52.52.52.52.52.52.52.5每管混匀后，室温放置10 min，测A595值A595nm五、结果及分析1、绘制标准曲线；2、以不同测定方法，计算出小白菜中蛋白质的百分含量； 样品中蛋白质的%=A样×消光系数（mg数/A标）÷样品体积（ml）×稀释倍数（如40倍）×总体积（如15ml）÷样品重量(g) ×100%Foin-酚法测蛋白质含量管号

7、12345678910标准蛋白（ug/ml）02550100150200250样品液（ml）1.01.01.0A（650nm）0.0000.1340.2160.3740.5240.6810.7400.5860.5800.612由所得数据可的出回归方程：y = 0.00298 X + 0.05149 其中相关系数R = 0.990947011 当吸光值A = y = 0.593nm 时，样品中蛋白质浓度C = X = 181.8 ug/ml 由公式 样品中蛋白质的%=标准曲线读数（ug/ml）×稀释倍数（20倍）×总体积（15ml）÷样品重量(2g) ×1

8、00%可得白菜中蛋白质的含量： 2.73% 考马斯亮蓝G-250法测蛋白质含量管号12345678910标准蛋白（ug/ml）01020406080100样品液（ml）1.01.01.0A（650nm）0.0000.1400.2280.3850.5190.6850.8000.4980.4680.520由所得数据可的出回归方程：y = 0.00779 X + 0.04899 其中相关系数R = 0.995442881 当吸光值A = y = 0.495 nm 时，样品中蛋白质浓度C = X = 57.31 ug/ml 由公式 样品中蛋白质的%=标准曲线读数（ug/ml）×稀释倍数（40

9、倍）×总体积（15ml）÷样品重量(2g) ×100%可得白菜中蛋白质的含量： 1.72% 思考：将二种试验方法所测得的结果进行比较，并说明数据之间存在差异性的原因。本实验所用的材料用哪种方法检测最好？为什么？ 附：常见食品蛋白质含量表 单位：克/100克 名称 含量 名称 含量 名称 含量 米 8 叶菜类 2 海带 8 面粉 10 红薯 2 花生 24 玉米 8 马铃薯 2 葵花子 30 小米 9 山药 2 核桃 16 干黄豆 36 萝卜 0.6 瘦猪肉 16 干绿豆 24 南瓜 0.3 瘦羊肉 17 干赤豆 21 西葫芦 0.5 牛肉 20 干豌豆 24 冬瓜 0.4 鸡肉 20 鲜毛豆 13 黄瓜 0.6 鸡蛋 12 黄豆芽