CO2在固定化啤酒酵母发酵过程中对挥发性芳香成分生成的影响_百替生物

1、Appl Microbiol Biotechnol (2004 64: 636643DOI 10.1007/s00253-003-1523-0BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTS AND PROCESS ENGINEERINGCO2在固定化啤酒酵母发酵过程中对挥发性芳香成分生成的影响H.-Y. Shen . S. De Schrijver . N. Moonjai .K. J. Verstrepen . F. Delvaux . F. R. DelvauxReceived: 1 September 2003 / Revised: 12 November 2003 / Accept

2、ed: 21 November 2003 / Published online: 16 December 2003Springer-Verlag 2003(赵瑞卿翻译摘要:相比于传统的游离式细胞发酵系统,固定化细胞发酵系统有着更大的好处。然而,当用这些发酵罐来生产酒精饮料时,混杂香味的产生就成了一个主要的问题。由于CO2对酵母的生长和代谢有抑制作用,因此一个更好的对风味成分控制的方法就是控制溶解的CO2的浓度。本文证明了固定的环境可以促进CO2从液体培养基中挥发出来,进而为发酵过程营造了一个低CO2的环境。此外,在固定化发酵中挥发性的高级醇和酯的产量要比传统游离式发酵高很多。往固定化发酵系统中

3、持续通入CO2(45ml/min,可导致旺盛发酵时期细胞的生长速率减少10%-30%,但是发酵速率却不受影响。支链氨基酸的吸收减少了8-22%,而且高级醇和酯的成分分别减少了15%和18%。这些研究结果表明:在固定化细胞系统中不适当的芳香剖析可以通过控制固定化发酵过程中溶解CO2来调整。前言:固定化细胞技术已经被应用于在酒精饮料(例如葡萄酒和啤酒的发酵中以提高发酵物的产率。在固定化系统内的高细胞密度对发酵率有积极的影响,但是,固定化系统内独特的微环境已经显著地影响到了固定化细胞的生理活动。先前的研究已经证实细胞的固定影响挥发性高级醇和酯的组成。此外,酵母中醋酸酯成分的活性已经被证实会受到细胞固

4、定化的积极性诱导,因为它可能与cAMP/PKA/Sch9等营养感觉信号通路的活性有关。因此,固定化发酵的最终产品与只运用自由悬浮酵母细胞的传统发酵的就能通过芳香剖析区分开来。在啤酒前发酵过程中,许多重要的高度芳香混合物会在酵母发酵中作为次级代谢产物而产生。许多参数例如温度、溶氧、中间产物、发酵罐的设计方案和最高压力都会影响到这些芳香混合物的组成成分。在啤酒酿造行业,CO2对发酵性能的影响在长期以来已经得到承认。在啤酒前发酵中,溶解CO2浓度的变化受到了发酵罐的尺寸和几何形状,固体微粒的存在,PH和温度的影响。例如,大的发酵管道会导致一个大的流体静力学的压力,从而使溶解CO2浓度的增加,进而使高

5、级醇和酯成分的减少。另一方面,CO2可以被用来在高温或高麦芽汁浓度的发酵中控制重要的高度芳香的挥发物的组成成分。CO2在水溶液中有很高的溶解度。它和水反应生成碳酸,碳酸部分水解成碳酸离子和质子(图 1。在一个低缓冲能力的基质中,这些反应会造成明显的PH下降,PH下降进一步的影响到了细胞代谢。更重要的是,CO2可以自由的渗入血浆膜中,溶解到细胞质中,释放重碳酸盐离子和质子。为了维持体内的PH,质子会通过与ATP联合的主动运输途径转移到外面的基质中,而ATP是直接为生物合成、生长和其他的细胞活动提供能量的。此外,据研究CO2能改变膜的特性,从而对溶质的运输产生负面的影响。同时CO2能和氨基酸及蛋白

6、质的肽单位反应,从而最终导致蛋白结构和活性的变化。而且,据报道,CO2对酶的活性有特定的影响,尤其是与羧化反应、去碳反应有关的酶。本项研究旨在阐明CO2在固定化酵母发酵过程中对高度芳香组成成分的影响。首先,在发酵过程中,固定化细胞系统中溶解的CO2量的变化会被监视以拿来和游离化细胞系统中的相比较。然后将CO2通入到一个含有固定化酵母细胞鼓气生物反应器中来观察CO2对固定化酵母细胞代谢活动的影响。CO2对固定化细胞系统中细胞数目、氨基酸的吸收和高级醇和酯的组成成分的影响在这项研究中得到了充分的评估。1材料和方法1.1材料1.1.1 菌种本文所用酵母是从麦芽酿酒科学文化收藏中心得来的酿造KUL.C

7、MBS.151的商业啤酒酵母。原种培养是在-70°C下加入了20%甘油(w/v的麦芽汁培养基上进行的。1.1.2 培养基和生长条件本培养基包含80g/l的葡萄糖,2.72g/l KH2PO4, 2.6 g/l (NH42SO4,4g/l的酵母抽提物(LAB M, Lancashire, UK,1.5g/l的柠檬酸(Sigma, Steinheim, Germany,6g/l 的柠檬酸钠,0.5 g/l MgSO4·7H2O, 0.5 g/l CaCl2·2H2O,40mg/l的吐温-80和0.42 mg/l ZnCl2,培养基的碳源和氮源121°C高压下

8、灭菌15min。培养基的最终pH为5.0±0.1,用柠檬酸和柠檬酸钠作为其缓冲液。将在Eppendorf管中的1 ml原种培养物接种到25ml的基质中,然后在20°C下150rpm振荡培养48h。将上述培养基转到250ml的新鲜培养基中在相同的条件下培育48h。在整个发酵试验过程中用的是相同的培养基。1.2 实验方法1.2.1 在圆柱形瓶子里里分别用游离的和固定化的细胞进行实验室规模的发酵实验室规模的发酵实验在500ml的圆柱形瓶子里进行以测定发酵过程中CO2溶解量的变化。取对数生长期的酵母细胞(107cells/ml接种到充满CO2的培养基(400ml,溶氧量8mg/ml

9、中,培养基有或没有固定化模板。溶氧量用一种溶氧量校正仪器(WTW Oxi340-A/SET, Weilheim, Germany测量。整个发酵过程维持在20°C.在发酵过程中用一个气塞来阻止外部的空气进入内部。固定化的模板是用一种多孔不锈钢光纤做成的,呈圆形,直径30mm,长30mm.在固定化细胞系统中,四片模板垂直放置以使细胞自由结合。加入模板后,总体积的增加量少于5%。(刘博远翻译1.2.2 在半体积圆锥形鼓气生物反应器中用固定化细胞进行的发酵为了进行上面的发酵实验构建了一个圆锥形鼓气生物反应器(长650mm,内径144mm并且带了一个同心导流管(长350mm,内径98mm。有效

10、的反应体积是7800ml。固定模板(长140mm,直径30mm放在导流管里面.另外,又制造了几个小的模板(长30mm,直径30mm,从而可以使用镊子从生物反应器的顶端进行多次取样。这些模板竖直放在导流管内,占用了不到5%的有效反应体积。接种之后(12 000 000cells/ml,酵母细胞在含有固定模板的生物反应器中15°C下培育20h以获得自由粘连在模板表面的细胞。在用消毒蒸馏水冲洗掉剩余的培养基和悬浮的细胞后, 用新鲜的培养基(容氧量8mg/ml更新发酵培养基。挂在固定模板上的原始细胞在6.57.5 *106cells/ml.为了研究CO2对固定化细胞发酵的影响,在里面的导流管

11、下面5cm处放置了一个多孔渗水的微型铝锅芯(长20cm,直径9cm孔径100-160m以通入CO2。CO2的流动速率通过一个流速校准仪保持在45ml/min。发酵在15°C下进行,取样间隔为24h。 图1 CO2在发酵培养基中可以与水化合进而水解生成重碳酸盐和质子。另外,CO2也可以自由渗入酵母的质膜中与细胞内的水反应生成重碳酸盐和质子。这些反应是可逆的,即使由于细胞内更高的pH,会导致细胞内的离解反应更优先。1.3 分析方法1.3.1 CO2溶解量的测定的溶解量用Zahm 新型大气碳酸计(Series 5000, Zahm & Nagel, Holland, N.Y. CO

12、2测定。小心地将发酵培养基(300ml转移到一个标准的啤酒瓶中,然后立即封上盖。剧烈振荡过后,用空气检漏计测量瓶子顶端的压力,同时记录培养基的温度。根据一个标准的温度与压力换算表,将压力换算成浓度(g/l。1.3.2 发酵培养基的检测每隔一段固定的时间,取发酵培养基在4°C1400g下离心,除去酵母细胞。培养基密度采用AP Paar DSA48和声波频率分析器(格拉茨,奥地利测量。为分析高度芳香混合物(高级醇,脂,取5ml培养基用带有装备有Chrompack-Wax 52 CB毛细管柱(长50 m; 直径0.32 mm;层厚度 1.2 m, Varian , Middelburg,荷

13、兰的氢火焰化离子检测器 (FID (Perkin-Elmer顶空进样器HS40 自动系统XL, Norwalk,美国康涅狄格州.的气相色谱仪进行气相色谱分析。进样前样品60°C预热16分钟。注射器和FID分别维持在180°C和250°C。用氦气作载气。结果用Perkin-Elmer Turbochrom Navigator软件(Perkin-Elmer,Norwalk, 美国康涅狄格州进行分析。培养基的氨基酸分析像前人描述的一样用dabsylation方法分析 (Shen等人. 2003a。发酵培养基用超滤插入物超滤蛋白质(UFC,超滤蛋白质Mr=5,000; M

14、illipore, Bedford, Mass. 并用dabsyl氯化物(12.4 mM 丙酮, Sigma衍生,用自动前置柱dabsylation装置(AS3500, Thermo-Finnigan, San Jose, Calif.。用乙腈/醋酸作为流动相,衍生的氨基酸在C18柱(长,150 mm; 直径, 4.6 mm;粒度, 5 m, Alltech, Deerfield, Ill.上被分离。包括一个预处理小柱(长30 mm; 直径 4.6 mm用,紫外探测器(UV3000HR, ThermoFinnigan.在365nm下进行检测。结果用PC1000 System 软件进行分析(Ve

15、r. 3.5, ThermoFinnigan。1.3.3 细胞中脂肪酸分析脂肪酸分析按照有一些改动后的Chen (1981的方法分析完成。将一团解冻的酵母细胞(湿重100mg悬浮在10ml (1:1 v/v氢氧化钾(1 N和甲醇的混合物中。添加十七烷酸(C17:0, 1.0 ml, 0.25 mg/ml甲醇溶液, Sigma作为内部标准。混合物煮沸30分钟完成皂化过程。在1ml氯化氢酸化后,混合中的脂肪酸被3ml正己烷离心萃取。重复提取过程,混合的有机相在氮气里干燥浓缩。脂肪酸甲酯由其在105°C烘箱箱中与1ml三氟化硼甲醇溶液(14%, Sigma反应10分钟后行成。脂肪酸甲酯用甲

16、苯萃取并准备好有机相用以气相色谱仪分析。样品使用装备了FID的Varian 3300气相色谱仪分析。毛细管柱(AT-225,长 30 m;直径0.32 mm;膜厚度, 0.25 m, Alltech用于分离脂肪酸甲酯,用氦气作为载气。烘箱温度设置100°C作为初始温度,然后以10°C/min逐渐增加到200°C。温度维持在200°C 6 分钟。注射器和检测器温度分别维持在250°C和230°C。结果用Chrom-Card软件分析(Varian, Walnut Creek, Calif.。刻度线的确定采用脂肪酸甲酯的标准(Alltech

17、。脂肪酸组成由样品比例的峰面积计算对比国内标准(C17:0。1.3.4 细胞数量的测定自由悬浮的细胞数量由血红细胞计数器计量。将固定的细胞模板上的细胞放在0.9%等渗氯化钠溶液中在摇床上4°C 350rpm进行20分钟培养后释放。细胞模板需要用冷却的蒸馏水以慢速涡流洗涤多次直至洗液的OD小于0.01。释放的细胞的悬浮液经1400g离心600nm和蒸馏水洗涤后称量湿重。游离细胞的模板由0.3%氢氧化钠溶液清洗,然后蒸馏水洗涤多次以清除底物沉淀,随后烘箱105°C过夜干燥。称重细胞按照干重毫克每克模板计量,从而转化成细胞数量。由此得到一个细胞干重与细胞数量的经验公式。细胞数量

18、(百万细胞/ml =15.2 × 细胞干重 (mg/ml, r2=0.97。另一个经验公式是细胞干重与细胞湿重的关系。细胞干重(mg =0.17 × 细胞湿重 (mg, r2=0.89。(颜书阁翻译2 结果2.1 游离的与固定化细胞发酵过程中溶解CO2的变化为研究细胞固定对于发酵速率和发酵过程中CO2溶解量的影响在Schott锥形瓶中进行了静态发酵实验。如图2所示,用固定模板进行的发酵过程中底物的利用水平提高了,这可以被发酵时培养基浓度的变化曲线所证明。此外,在整个发酵过程中,固定化细胞系统中溶解CO2的水平比游离细胞系统的要低。比如,经过28小时发酵之后,固定化细胞系统中

19、溶解CO2的浓度只有游离细胞系统的50%。酵母菌发酵过程中,1克葡萄糖大约被转化成0.5克乙醇和0.5克CO2。在此基础之上,经过28小时发酵之后,根据蔗糖消耗的总量(19.8克提供给固定化细胞系统,12.9克提供给游离细胞系统,固定化细胞系统产生的CO2占到了2.4%,而游离细胞系统中只有1.6%。此外,发酵过程中可以在固定化细胞模板周围发现更多的CO2气泡结晶现象。这说明,固定细胞体系中产生的CO2被更高效地从液相移除,导致了溶解CO2的浓度低下。 图2实验室条件下培养基提取物浓度(实线和相对溶解的CO2水平(虚线在游离细胞(和固定化细胞(系统中发酵时的变化 图3 A是在固定细胞系统(中不

20、通入CO2但在(通入CO2,两者培养基提取物浓度的变化。B在无CO2通入的条件下固定化细胞系统中细胞数量的变化:总细胞数,×固定细胞数,游离细胞数。C在有二氧化碳鼓泡搅拌条件下固定细胞体系细胞数量的变化:总细胞数,×固定细胞数,游离细胞数。总细胞数是固定和游离的细胞数量的总和。2.2 固定细胞发酵中去除二氧化碳的影响为了进一步研究CO2在固定化细胞发酵过程中的作用,我们在CO2气流可以被导入和去除的鼓气生物反应容器中进行了一个新的发酵试验。用一个带有缓冲能力的完全培养基来模拟工业植物培养基以便减少溶解CO2对培养基的酸化作用。在有CO2通入的情况下,培养基的pH从5.09降

21、到了4.58;在没有CO2通入的情况下,培养基的pH从5.11降到了4.63。这说明了培养基具有很好的缓冲能力。 表1 在发酵结束时(80 %发酵进程在固定化细胞系统中没有CO2 通入和有CO2 通入是游离细胞和固定细胞细胞中脂肪酸的成分。结果是平均值±标准误图2中显示了发酵曲线。固定化细胞系统中是否通入CO2并没有使发酵速率产生较大区别(图 3A。但是在两种情况下,细胞数量却有较大不同。(图 3BC通入CO2的系统对于游离细胞和固定细胞的生长都有负面影响。在起初三天的发酵过程中,有CO2通入的情况下,游离细胞的数量平均下降30%,固定细胞的数量平均下降10%。CO2也被认为与细胞膜

22、的磷脂有关,它会影响到细胞膜的流动性和通透性的等膜的主要性质。然而,在我们的实验中并没有发现CO2对于游离细胞或者固定细胞脂肪酸的形成造成显著影响。然而,游离细胞和固定细胞中不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比例却有所不同。固定细胞中较低含量的不饱和脂肪酸证实了我们先前的实验结果,细胞的固定影响细胞膜脂肪酸的形成。2.3 发酵中CO2对挥发性高级醇类和脂类生成的影响挥发性混合物的组成决定了酒精饮料的香味。据报道,在发酵中挥发性高级醇类和脂类的组成受到细胞固定化的影响。此研究中,经过96个小时的发酵后,发酵产物中的挥发性高级醇类和脂类用气相色谱分析仪进行分析。在平均水平上,固定化细胞发酵系统比游离细胞发

23、酵系统产生更多的高级醇类和脂类(表 2,与我们先前的发现一致。在固定化细胞发酵系统中发酵产生的乙酸异丁酯和乙酸异戊酯分别是在游离细胞发酵系统中产生的3倍和6倍。这也许是在固定化细胞发酵系统中能够相对快速发酵的的结果(图 2。酵母新陈代谢时产生的CO2的有效去除可能也和挥发性醇类和脂类生成的提高有关。在游离的和固定化细胞发酵系统中,乙酸异戊酯和乙酸异戊醇的比例显示,醇的形成可能与细胞固定化的诱导有关。以前的研究显示,在无酒精啤酒发酵中固定化的细胞能够提高控制酯类形成的乙酰基转移酶的活性。更进一步证明,在固定化的细胞中能够编码乙酰基转移酶的ATF1基因能够更充分的表达。(陈祥东翻译高级醇类和脂类的

24、形成受到CO2 压力的影响。在固定化细胞发酵中CO2对挥发物的生成的影响得到了更详细的研究。在发酵过程中,监控缬氨酸和亮氨酸的利用情况。两种氨基酸被利用分别生成乙酸异丁醇和乙酸异戊醇。图4A ,B显示,通入CO2的固定化细胞发酵系统比正常的固定化细胞发酵系统对缬氨酸和亮氨酸的利用分别减少了22%和8%。与预期一样,高级醇的形成受CO2 的影响。与没有通入CO2的固定化细胞发酵系统比较,在通入CO2的固定化细胞发酵系统中观察到高级醇的生成减少(图4C-E。丙醇和乙酸异戊醇的减少达20%之多,尽管这对于乙酸异丁醇没有意义。丙醇的前体苏氨酸也被利用;但是在通入和未通入CO2的系统中没有观察到明显的区

25、别。酯的生成的变化见图4F-H。在发酵过程中,通入CO2的固定化细胞发酵系统产生的酯与正常的系统比较生成的较慢并到达一个较低的最高水平。另外,在固定化细胞发酵过程中,酯的形成比高级醇的形成对CO2 的通入更敏感。通入CO2后酯的减少范围在17%(乙酸乙酯到30%(乙酸异戊酯和己酸酯之间。 表2 经过96小时发酵后在游离细胞系统和固定化细胞系统中发酵的进程和挥发性高级醇类和脂类的浓度。结果为平均值±标准误。3 讨论以前的研究证明细胞固定化能够提高发酵产率。尽管无法提供可靠的证据,但可以推测固定化固体材料可能使去除CO2 更容易2从而提高发酵水平。在沼气塔反应器中,淤泥微粒能够提高在液体

26、培养基中的除气作用。Siebert等证明一些微粒,如残渣、活性炭和硅藻土,在啤酒发酵中能够促进酵母细胞的生长、酵母细胞的集中和发酵的进行。同时,在添加微粒的发酵麦芽汁培养基的发酵过程中观测到较低的CO2浓度。当前研究的结果提供的证据显示,与其他固体颗粒类似,发酵时使用固定化模板可能也是CO2气泡结晶成核时的核子。与游离细胞的发酵系统相比较,在固定化细胞发酵系统中较低的溶解的CO2可能和较快的发酵速度有关。溶解的CO2对酵母细胞的生长、细胞体积、酶活性和DNA容量产生抑制作用。另外,溶解的CO2 能够导致对各种氨基酸利用的改变,这与最初的利用比例有关。特别的,增加CO2压力能够减少对支链氨基酸的

27、利用,如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等,同时,另外一些氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和赖氨酸的利用却受到较小的影响。在此研究中,也发现在固定化细胞中CO2对支链氨基酸的利用具有抑制作用。 图4 发酵过程中固定化细胞系统中不通入( CO2 和通入( CO2 时支链氨基酸的变化与 高级醇和酯的形成曲线。A,B 支链氨基酸的变化：A 缬氨酸，B 亮氨酸。C-E 高级醇类 的形成：C 丙醇，D 异丁醇，E 异戊醇。F-H 高级脂类的形成：F 己酸乙酯，G 乙酸乙 酯，H 乙酸异戊酯。 具有芳香味的高级醇和酯与酵母细胞的生长和培养基的利用具有密切的相关性。 这个 研究的结果证明在固定化细胞中溶解的CO2

28、可能对高级醇和酯的形成产生影响。高级醇能 够作为次级产物在支链氨基酸的分解和合成途径中形成。在分解途径中，也叫Ehrlich途 径，第一步是一个转氨反应，生成一个- 酮酸。这些酮酸在随后的反应中脱去羧基形成 醛，然后进一步形成各自的高级醇。在外源氨基酸足够时，分解途径是主要的。当外源氨 基酸耗尽时或有分解代谢抑制物出现时， 高级醇就会通过合成途径生成。 从碳源中衍生的 - 酮酸能够转化为相应的醇。 高级醇的浓度决定于相应的氨基酸和糖类的利用效率。 这 也许能够解释为什么某些高级醇（如丙醇，异戊醇）形成时与相应的氨基酸（分别是苏氨 酸和亮氨酸）被利用时相比CO2 的作用更显著。氨基酸的利用直接或

29、间接的和产物的数量 有关。 因此， 在溶解的CO2 作用下高级醇的生成的减少可能与降低了的细胞生长水平有关， 这在此项研究中也观测到了（图3B-C） 。而且，氨基酸利用的改变能够直接导致高级醇形 成的减少。此外，去碳酸基反应对酮酸生成高级醇可能也是必要的，这个反应受到溶解的 CO2影响。 另外一组具有芳香味的挥发性醋酸酯是由乙酰基转移酶催化相应的醇和辅酶A之间的 缩合反应形成的。由于抑制细胞的生长或直接对去碳酸基反应的直接影响，溶解的CO2 可 能减少了培养基的有效成分，即高级醇和辅酶A ，从而减少了酯形成。Landaud等人研究 表明，在CO2 压力下，酯的形成与相应的高级醇的单位体积的量的

30、相关性比与其有效性的 相关性更强。本研究中，细胞的生长和高级醇的形成都受到溶解的CO2 的牵制。两者联合 的影响也许是造成在通入CO2 的固定化细胞发酵系统中的较低的酯生成原因。除了溶解的 CO2 可能对挥发物的形成造成新陈代谢方面的影响外，通入的CO2 也可能在用气体剥离的 方法是去除了部分挥发性物质。 为了研究气体剥离影响的程度， 在固定化细胞发酵系统中 通以等量氮气（数据没有显示） 。在与同样的未通如氮气的系统比较时，酯的形成减少但 高级醇的形成增加。在麦芽汁培养基中，挥发物的去除程度是有亨利定律常数决定的。同 样的， 在气体剥离时酯比高级醇更易从麦芽汁培养基中去除。 通以氮气时酯的减少

31、量显示， 在通以CO2 的固定化细胞发酵系统中，气体剥离的影响也是造成挥发性混合物减少的原 因。 在通以氮气时高级醇的增加显示在通气反应器中气体剥离可能增加了大量的传递物从 service 而造成代谢活动的提高。 总之，固定化模板的出现不仅为细胞提供了附着物，而且是CO2 气泡形成的成核位点， 因此，使CO2 更容易去除。反过来说，这对酵母细胞的生理活动和重要的次级具有芳香味 的次级产物的形成产生了深刻影响。在固定化细胞系统中酵母细胞生理的改变也许是CO2 抑制作用的结果， 加之由于细胞或表面的接触和大量的传递物的限制使细胞发生改变。 在 固定化细胞中发酵终产物中混杂香味产物的组成变化与在游离

32、细胞中发酵的相比较可能 是以上所有因素导致的结果。基于本研究的结果，CO2 能够用来影响在固定化细胞发酵系 统中挥发物的产量，这也许能够为在酒精饮料生产中的混杂香味问题提供一个解决的办 法。 致谢 H.-Y. Shen and N. Moonjai是the Research Council, K.U. Leuven.博士奖学金的获得者。 F.R.Delvaux非常感谢the K.U.Leuven Research Fund (O.T./03/40.的财政支持。K.J. Verstrepen是the Fund for Scientific Research-Flanders (FWOVlaand

33、eren的研究助理。 我们也 向Ir. B. Janssens 和 Ir. M. Kelgtermans表示诚挚的感谢，感谢他们为我们提供的理论和实 际上的支持帮助，感谢他们帮我们做的色谱分析。同时，非常感谢Bekaert (Zwevegem, Belgium为我们提供固定化基体。 参考文献 1 Arcay-Ledezma GJ, Slaughter JC (1984 The response of Saccharomyces cerevisiae to fermentation under carbon dioxide pressure. J Inst Brew 90:8184 2 Bard

34、i EP, Koutinas AA (1994 Immobilisation of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low temperature wine making. J Agric Food Chem 42:221226 3 Castelli A, Littaru GP, Barbesi G (1969 Effect of pH and CO2 concentration changes on lipids and fatty acids of Saccharomyces cerevis

35、iae. Arch Mikrobiol 66:3439 4 Chen EC-H (1981 Fatty acid profiles of some cultured and wild yeasts in brewery. J Am Soc Brew Chem 39:117124 5 Debourg A (1999 Yeast flavour metabolites. Eur Brew Conv Monogr 28:6073 6 Dickinson JR (1999 The catabolism of branched-chain amino acids to fusel alcohols. E

36、ur Brew Conv Monogr 28:7481 7 Dixon NM, Kell DB (1989 The inhibition by CO2 of the growth and metabolism of microorganisms. J Appl Bacteriol 67:109 136 8 Doran PM, Bailey JE (1986 Effects of immobilization on growth, fermentation properties, and macromolecular composition of Saccharomyces cerevisiae

37、 attached to gelatin. Biotechnol Bioeng 28:7387 9 Iersel MFM van, van Dieren B, Rombouts FM, Abee T (1999 10 Flavor formation and cell physiology during the production of alcohol-free beer with immobilized Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol 24:407411 service 11 Knatchbull FB, Slaughter

38、JC (1987 The effect of low CO2 pressures on the absorption of amino acids and production of flavour-active volatiles by yeast. J Inst Brew 93:420424 12 Kruger L, Pickerell ATW, Axcell B (1992 The sensitivity of different brewing yeast strains to carbon dioxide inhibition fermentation and production

39、of flavor-active volatile compounds. J Inst Brew 98:133138 13 Landaud S, Latrille E, Corrieu G (2001 Top pressure and temperature control of the fusel alcohol/ester ratio through yeast growth in beer fermentation. J Inst Brew 107:107117 14 Lumsden WB, Duffus JH, Slaughter JC (1987 Effects of CO2 on

40、budding and fission yeasts. J Gen Microbiol 133:877881 15 Masschelein CA, Ryder DS, Simon JP (1994 Immobilized cell technology in beer production. Crit Rev Biotechnol 14:155 McIntyre M, McNeil B (1998 Morphogenetic and biochemical effects of dissolved carbon dioxide on filamentous fungi in submerged

41、 cultivation. Appl Microbiol Biotechnol 50:291298 16 Meilgaard M (2001 Effects on flavour of innovations in brewery equipment and processing: a review. J Inst Brew 107:271286 17 Oshita K, Kubota M, Uchida M, Ono M (1995 Clarification of the relationship between fusel alcohol formation and amino acid

42、 assimilation by brewing yeast using 13C-labeled amino acid. In: European Brewing Convention (ed Proceedings of the 25th Congress of the European Brewing Convention. Oxford University Press, New York, pp 387394 18 Pietsch T, Mehrwald R, Grajetzki R, Sens J, Markl H (2003 Sedimentation behaviour of s

43、ludge particles in a biogas tower reactor and the function of a hydrostatically pressurized sedimenter. Water Res 37:10711079 19 Renger RS, Vanhateren SH, Luyben K (1992 The formation of esters and higher alcohols during brewery fermentation-the effect of carbon dioxide pressure. J Inst Brew 98:509513 20 Schott JA, OReilly AM (1995 Use of a flexible sponge matrix to immobilize yeast for beer fermentation. J Am Soc Brew Chem 53:6771 21 Schott JA, Trotin M (1997 Re