Bio-Rad 荧光定量PCR-iQ5说明书_图文

1、1. iQ5多重实时荧光定量 PCR 仪简介在现代分子生物学的发展过程中, 核酸放大技术的出现及与之相关的检测技 术的成熟起到了至关重要的作用,而实时荧光定量 PCR 技术可以说是两者完美 的结晶。 它通过加入能与 DNA 结合的荧光染料或在引物 /探针上标记荧光基团等 方法,在 PCR 过程中,随着产物的量不断增加,荧光信号也随之发生相关性的 变化,再通过数学处理,算出原始靶 DNA 的含量。实时荧光定量 PCR 技术可以在较大的动力学范围内实现精确定量,其灵敏 度也达到相当高的程度。随着这项技术的发展,其专用的实时荧光定量 PCR 仪 也应运而生。我们伯乐公司这次推出的 iQ5 多重实时荧

2、光定量 PCR 仪是在 iCycler 荧光定量 PCR 仪的基础上强化而成,以求性能达到最优。iQ5 多重实时荧光定量 PCR 仪所装配的光源(钨卤素灯拥有更宽的光 谱范围,给予用户在其选择上最大限度的灵活性。经过优化的激发 /发射透镜组 可以显著提高多重 PCR 的灵敏度,减少多重荧光之间的干扰。它的 CCD 检测 器可以同时监测 96个反应孔的荧光数据。在热循环过程中,当前完整的实验数 据会被软件实时地以图解的形式表现出来。实时的数据显示可以大大提高反应孔与孔之间数据比较的可靠性, iQ5 多 重实时荧光定量 PCR 仪则可以方便地实现数据实时显示,有利于及时反馈试验 状况。 以上介绍的

3、各项特性保证了 iQ5 多重实时荧光定量 PCR 仪在使用过程 中具有更强的可靠性和灵活性。iQ5 多重实时荧光定量 PCR 仪所配备的运行、分析软件设计得十分人性 化, 且功能强大。 其功能模块的界面模式可使用户可以快速地完成各种操作。 当 用户把光标放在软件的功能键上时, 其下方还会出现相应说明文字。 此外, 按键 盘的“ F1”键还可以启动在线帮助指南。当用户设定完结果分析参数后,点一 键即可得到最终分析结果。2. iQ5使用快速指南2.1 如何用 iQ5运行一次实验2.1.1 综述1. 创建、选择或修改一个反应程序文件(Protocol file 2. 创建、选择或修改一个反应板设置文

4、件(Plate Setup file 。 3. 点击“ Run ”键。 4. 以选定的反应板设置文件和反应程序文件进行反应。 2.1.2反应程序文件(Protocol file设置指南用户可以在 Workshop 模块中, 创建一个新的反应程序文件, 或是直接选择或修 改一个已有的反应程序文件。2.1.2.1 选择一个已有的反应程序文件1. 点击“ Protocol ”键,在弹出的浏览器中选定所要选择的反应程序文件的路径。2. 点击所需的反应程序文件的文件名,此时该文件的具体设置在“ Selected Protocol ”窗口中显示出来。 注意:iQ5软件安装后, 里面会自带一些我们设置好的反

5、应程序文件作为示例, 用户可以直接调用它们。2.1.2.2 创建或修改一个反应程序文件在“ Selected Protocol”窗口点击“ Edit ”键即可对当前的反应程序文件进行修 改;在“ Selected Protocol”窗口点击“ Create New”键即可创建一个新的反应程 序文件。无论点击“ Edit ”或“ Create New”键,软件都会自动切入“ Protocol Edit”窗 口。 这个窗口下部有一显示反应内容的表格,用户可以在其中按自己的需求进行修 改。1. 修改保温时间和保温温度。“ Dwell Time”列设置保温时间, “ Setpoint ”列设置保温温度

6、。如果用户要设置 一个 10秒的保温时间,那就要在相应格中输入 0:10或者 0.10。2. 选择荧光数据收集步骤“ Data Acquisition”列用于设置荧光数据收集步骤。其中“ Real-Time ”选项用 于荧光定量, “ Melt Curve”用于熔点曲线分析。注意:如要进行荧光 PCR 实验, 必须保证程序中至少有一个荧光数据收集步骤。 3. 插入循环或步骤在表格中“ Cycle ”列有数字显示的行,点击该行“ Insert ”列的“ +” ,即可完成 循环插入,系统默认插入的循环在当前循环之后。在表格中“ Step ”列有数字显示的行,点击该行“ Insert ”列的“ +”

7、 ,即可完成 步骤插入,系统默认插入的步骤在当前步骤之后。4. 删除循环或步骤点击某 Cycle 行 “ Delete ”列的“×” ,即可将该循环删除。点击某 Step 行 “ Delete ”列的“×” ,即可将该步骤删除。5. 文件保存点击“ Save and Exit Protocol Editing”键,在随后出现的“ Save as”对话框中 输入程序文件的名称,再点击“ Save ”键即可完成保存。注意:点击“ Save and Exit Protocol Editing”键或“ Cancel and Exit Protocol Editing ”键才能退出“

8、 Protocol Edit”窗口。2.1.3反应板设置文件(Plate Setup file设置指南1. 在 Workshop 模块中,用户可以:a. 点击反应板设置文件显示区的“ Create New”键创建一个新的反应板设 置文件;b. 点击反应板设置文件显示区的“ Plate ”键,在浏览器中选择想要的反应 板设置文件的路径并双击其文件名,即可选中该文件;c. 点击反应板设置文件显示区的“ Plate ”键打开浏览器,选择想要的反应 板设置文件的路径并双击其文件名,再点击“ Edit ”键即可对该文件进行 修改;d. 点击“ Data File”键,在随后出现的浏览器中选择数据文件。点

9、击其文 件名即可打开其关联的反应板设置文件,再点击“ Edit ”键即可对其进行 修改。2. 在“ Notes ”栏中输入或修改对该文件的说明。3. 在样品体积 (Sample Volume 、 封板类型 (Seal Type 、 反应容器类型 (Vessel Type 各项设置中输入或修改相应内容。4. 输入或修改文件名。5. 点击 “ Select/Add Fluorophores” 键选择本次实验所要使用的荧光染料种类, 在软件中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。6. 如果“ Whole Plate Loading”显示在取消状态,请选择该选项选项。注意当 用户修改一个反应板设置

10、文件时,该选项为不可用。7. 点击某一样品类型图标。 8. 用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。9. 点击某一荧光染料图标。10. 用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。11. 重复以上 78两个步骤,直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部 设置完毕。12. 如要取消某孔此前的所有设置,点击“ Delete All”键,再点击该孔。13. 如要取消某孔此前的荧光染料设置,点击“ Delete Fluorophore”键,再点击 该孔。14. 如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard ,点击 “ Dilution Series”键可设置其原始靶核酸数量。

11、以上为所有反应板设置文件共通的部分, 根据反应板设置文件对应类型不同, 以下的步骤有所区别。a. 单色荧光检测(Single-Color Experiments15. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。b. 多色荧光检测并启用 “ Whole Plate Loading” 选项 (Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Selected15. 点击第二荧光染料对应的图标。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料,点击“ Del

12、ete Fluophore”图标并点击 相应反应孔。17. 点击“ Paint Can”图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应的反应孔。19. 重复 78两个步骤,直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置 完毕。20. 重复 1519的步骤,把第三、第四荧光染料设置完毕(如有需要 。21. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。c. 多色荧光检测并不启用 “ Whole Plate Loading” 选项 (Multi-Color Experiments with W

13、hole Plate Loading Deselected15. 点击第二荧光染料对应的图标。 此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会 显示, 但其样品类型不会显示。 同样在设置第三及第四荧光染料时, 此前的 荧光染料对应的样品类型也不会显示。 16. 如要取消当前选择的第二荧光染料,点击“ Delete Fluophore”图标并点击 相应反应孔。17. 点击某一样品类型图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。19. 重复 1718两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。20. 如要某些反应孔第二荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard ,点击

14、“ Dilution Series”键可设置其原始靶核酸数量。21. 重复 1520的步骤,把第三、第四荧光染料设置完毕(如有需要 。22. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。2.1.4 反应运行指南点击“ Workshop ”模块的“ Run ”键,软件即会切入“ Run-Time Central”模 块的“ Initiate Run”界面。2.1.4.1 开始运行一次反应1. 在“ Initiate Run”界面选择所要使用的反应程序文件和反应板设置文件。2. 选择孔间差异因子

15、计算方式。 3. 点击“ Begin Run”键。4. 在弹出的“ Save Optical Data File”对话框中输入数据文件的文件名。5. 点击“ OK ”键。2.1.4.2 反应运行实时监控在反应运行开始后,软件会切入“ Monitor Run”界面,在这里会实时显示反应 状况。在反应结束后,会自动弹出“ Run Status”对话框。 如点击“ Yes ” ,软件会切入“ Data Analysis”模块显示本次反应的数据。如点 击“ No ” ,软件会退回“ Workshop ”模块。2.2 数据分析指南2.2.1 综述“ Data Analysis” 模块的主要功能就是让用户

16、进行实验数据分析。 当用户刚打开 iQ5软件时, “ Data Analysis”模块的切换键显示为灰色不可选。用户只有通 过 “ Workshop ” 模块的 “ Data File” 界面选择一数据文件后点击 “ Analyze ” 键, 即可进入“ Data Analysis”模块。“ Data Analysis”模块分为以下六个功能界面:PCR Quant:顾名思义,该界面是用于 PCR 定量分析的。用户可以在这里定义 本底、临界阈值等等参数从而计算出每孔靶 DNA 的原始值,而根据标准曲线计 算出的各孔 PCR 效率也会在这里显示出来。同时,本界面也为下面 End Point、 Ge

17、ne Expr和 Allelic Disc等界面工作提供必要的数据。Melt Curve/Peak:该界面用于分析双链 DNA 的熔点温度(T m 值 。用户可以通 过加入能与双链 DNA 结合的荧光染料(比如 SYBR Green I等或荧光标记的杂 交探针进行反应,再用该界面进行分析。End Point:终点法分析, 它通过样品相对荧光读数 (Ralative Fluorescence Unit, 简称 RFU 终值来对样品的阴、阳性进行定性判断。Allelic Disc:该界面可以通过与已知基因型样品的数据进行比较得到未知样品的 基因型结果。用户可以通过临界循环数或 RFU 来确定样品是

18、野生纯合子、变异 纯合子还是杂合子。Gene Expr:该界面可以提供一些分析工具用于基因表达分析。它既可以让目标 基因和其他基因的表达进行比较, 也可以将目标基因不同时期或不同生长环境之 间进行比较。Edit Plate:在这个界面里,用户可以对反应板设置文件中的各孔的反应类型进 行修改, 也可以对标准品对应的原始靶核酸量进行修改。 这样, 万一用户在实验 运行前设置发生错误的话, 在这里可以很方便地进行修改。 注意, 如果用户在这 里修改后,原始的反应板文件并不会被覆盖。2.2.2 PCR Quant 界面设置指南“ PCR Quant”界面主要的功能是设置本底和临界阈值等参数来进行 PC

19、R 定量 计算。 当这些参数设置完成后, 软件就会自动分析出每孔样品的临界循环数。 如 果用户之前设定了标准品, 那么此时软件还会计算出其他各孔样品的原始靶核酸 含量。对于多重荧光 PCR 来说,任一种荧光染料对应的数据均可实现以上分析 功能。在本界面中,主要实现以下设置:设置荧光 PCR 的本底;设置临界阈值;添加或删除需要分析的反应孔。数据分析步骤:1. “ Workshop ”模块中点击“ Data File”键。2. 选择一个数据文件,点击“ Analyze ”键,软件会自动切入“ PCR Quant” 界面,并自动设置本底和临界阈值。3. 用户可根据需要,通过“ Analyze We

20、lls”选项添加或删除需分析的反应孔。4. 如果当前界面不是“ PCR Quant”界面,请点击“ PCR Quant”切换键。第 一次进入一个数据文件时,软件会自动设置本底和临界阈值。如果某个数据 文件被修改保存后再打开,此时显示的是最近一次修改的内容。5. 按照需要手动调节本底。6. 按照需要手动调节临界阈值。7. 在手动调节时, 用户可以随时通过右击曲线图选择 “ Baseline Threshold from the context menu”返回软件自动调节模式。2.2.3 Melt Curve/Peak界面设置指南1. “ Workshop ” 模块中点击 “ Data File”

21、 键, 选择一个数据文件, 点击 “ Analyze ” 键,软件会自动切入“ Data Analysis”模块。2. 点击“ Melt Curve/Peak”切换键进入该界面,此时熔点曲线图及其峰图就会 显示出来。3. 用户可根据需要,通过“ Analyze Wells”选项添加或删除需分析的反应孔。4. 右击熔点曲线图,在弹出的对话框中可以选择参数调整、复制图表、打印图 表等等操作。5. 拖曳临界阈值条,将该值调整到合适的位置。6. 用户可以在列表中选择某一峰,然后点击“ Delete Selected Peak”即可在 图中删除该峰。用 Shift 组合键可以实现群删。7. 点击“ Ed

22、it Melt Peak Begin/End Temp”键可对默认设置进行修改。8. 点击“ Restore Default”可以返回默认设置。2.2.3 End Point 界面设置指南用户可以采取以下两个方法进入该界面进行终点法分析:在运行时点击“ Run End Point”键。进入“ Data Analysis”模块后点击“ End Point”切换键。以下就分别就这两种方法进行说明方法一 终点法运行1. 将加好样、封闭完成的反应板放到仪器的加热模块上,合上热盖。2. 在“ Workshop ”模块中设置好反应板设置文件。3. 点击“ Run End Point”键。4. 进入“ Ru

23、n-Time Center”模块的“ Initiate Run”界面,调整完反应程序文 件后,点击“ Begin Run”键。注意:进行终点法分析时,其孔间差异因子必须恒定。5. 输入其数据文件名,点击“ Save ”键保存。6. 当反应运行完成后,软件会自动切入“ End Point”界面。7. 调整以下参数:分析方法运用“ Nagatives ”区分出那些未扩增的反应孔终点误差及误差参数。8. 用户可根据需要,通过“ Analyze Wells”选项添加或删除需分析的反应孔。9. 在“ Define Control”中定义阴性对照和阳性对照。10. 点击“ Recalculate ”键,软

24、件进行分析。并在“ Unknowns Call”中给出每个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。11. 点击“ Report ”键获得分析报告。方法二 终点法数据分析1. “ Workshop ”模块中点击“ Data File”键,选择一个数据文件。2. 点击“ Analyze ”键。3. 点击“ EndPoint ”切换键进入该界面。4. 调整以下参数:分析方法运用“ Nagatives ”区分出那些未扩增的反应孔终点误差及误差参数。5. 用户可根据需要,通过“ Analyze Wells”选项添加或删除需分析的反应孔。6. 在“ Define Control”中定义阴性对照和阳性对照。

25、7. 点击“ Recalculate ”键,软件进行分析。并在“ Unknowns Call”中给出每 个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。8. 点击“ Report ”键获得分析报告。2.2.4 Allelic Disc 界面指南该界面通过对样品临界循环数或 RFU 值进行统计分析,绘制散点图来区别不同 基因型。1. “ Workshop ”模块中点击“ Data File”键,选择一个数据文件。2. 点击“ Analyze ”键,软件会切入“ PCR Quant”界面,系统会自动设置本 底和临界阈值,如用户想对其进行修改,参看上文相关内容。3. 用户可根据需要,通过“ Analyze

26、 Wells”选项添加或删除需分析的反应孔。4. 点击“ Allelic Disc”切换键进入该界面。5. 在“ Assign Fluorophores”栏中选择各基因型对应的荧光染料。 6. 在“ Display Mode”栏中选择统计数据的类型(临界循环数还是 RFU 。 “ Threshold Cycle”代表临界循环数。注意:如一样品在反应中其荧光读数未超过临界阈值, 则在散点图上该样品的临 界循环数将会表示成反应循环的总数。“ RFU ”代表相对荧光读数。用户可以通过“ Select Cycle”来选择取哪个循环 的读数进行分析。7. 选择“ Automatic Call”或者“ M

27、anual Call ”来进行分析,其中“ Automatic Call ” (自动分析是默认模式。 a. 在“ Automatic Call”模式中,软件会自动生成散点图进行分析。 对照 1和对照 2都必须至少重复三孔。如没有命名对照,则轴线上会显示 90%的临界循环数或 10%的 RFU 。 用户可以拖曳阈值线进行调整。b. “ Manual Call ”是另一种分析模式,用户可以手动在散点图或数据列表 中修改参数。散点图:在“ Allele Call”选好相应选项后,用户可以移动十字光标选择图 中对应的样品点。软件会自动在图中做出调整,在列表中也同时发生相应的 变化。数据列表:用户可在数

28、据列表中修改“ Call ”栏相应内容,散点图中也会据 此发生相应变化。8. 点击“ Report ”键获得分析报告。2.2.5 Gene Expr 界面指南在本界面中,软件会以定量 PCR 为基础对基因之间的表达进行比较。比如取两 个基因进行比较,一个反应孔里有 100ng cDNA,另一个只有 1ng cDNA,通过 定量 PCR 分析就能得到其相对的关系。iQ5软件提供了两种基因表达比较模式:相对表达和校正表达。前者直接用样 品的 C T 值进行比较。后者则设定一个恒定量对照基因,用样品与其的对照值进 行比较,该基因事先要用细胞数测定、 RNA 丰度等非 PCR 方法定好量。比如样 品

29、A 和 B ,两者 C T 值相同。用前者比较就 1:1。如果用后者,如果设定相同 C T 值 时, A 的荧光染料与对照基因对比值是 B 的荧光染料与对照基因对比值 B 的荧光染 料的两倍时候,那结果就会是 2:1。2.2.5.1 相对表达指南1. 根据上文所述,在“ PCR Quant”界面调整好定量 PCR 参数。2. 点击“ Gene Expr”切换键,进入该界面。3. 选择“ Relative Quantity”的分析模式。4. 如有需要,可调节相应参数。5. 点击“ Recalculate ”键获得结果。2.2.5.2 校正表达指南1. 根据上文所述,在“ PCR Quant”界面

30、调整好定量 PCR 参数。2. 点击“ Gene Expr”切换键,进入该界面。3. 选择“ Normalized Quantity”的分析模式。4. 如有需要,可调节相应参数。5. 在表达设置中选择相应基因。6. 点击“ Recalculate ”键获得结果。2.2.6 Edit Plate 界面指南该界面用于完成反应后修改反应板设置文件。1. 有两种方法进入“ Data Analysis”模块:a. 在“ Workshop ”模块中点击“ Data File”键,在随后出现的浏览器内找 到所要数据文件的路径,双击其文件名,就会切入“ Data Analysis”模 块。b. 在“ Work

31、shop ”模块中点击“ Data File”键,在随后出现的浏览器内找 到所要数据文件的路径,单击其文件名,再点击“ Analyze ”键。 2. 点击“ Edit Plate”切换键。 3. 此时切入“ Edit Plate”界面。注意,在这个界面中,荧光染料方面的设置是 无法进行修改。 4. 在“ Notes ”栏可对反应说明进行修改。5. 在“ Experiment Name”栏可对数据文件名进行修改。6. 如果 “ Whole Plate Loading” 选项不可用, 则取消其相关设定, 相反则保留。 如果切入界面时该选项就不可用,那么在该界面就无法打开这个选项。 7. 样品类型修

32、改步骤:a. 点击选择一种荧光染料。b. 点击选择一种样品类型图标。c. 在“ Next ”栏里选择样品群的数量。d. 在“ Replicate ”区选择该样品类型对应的区域定义方式。e. 用户也可以通过单击目标反应孔的方法修改其样品类型。f. 重复步骤 be,完成该荧光染料对应的其他样品类型的修改。g. 重复步骤 af,完成其他荧光染料对应样品类型的修改。8. 标准品含量修改步骤:a. 点击选择标准品对应的荧光染料。b. 点击“ Dilution Series”让软件自动计算标准品含量,或者手动输入。 9. 在“ Units ”栏选择标准品计量单位。10. 完成修改后,点击“ Apply P

33、late Changes”键,软件会根据修改对数据重新 分析。 11. 如想返回原始设置,点击“ Restore Original Plate”键,即可完成。 2.3 系统校正指南2.3.1 综述在“ Calibration ”模块中,用户可以对 iQ5 多重实时荧光定量 PCR 仪的光学 成象系统进行校正。一般校正步骤:1. 掩模对准2. 本底校准3. 恒定孔间差异因子的检测4. 纯染料校正校正操作材料准备1. iCycler iQ 校正系列试剂(iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set2. iCycler iQ 内部孔间差异因子系列试剂(iCycler

34、iQ External Well Factor Solution Set3. 3块 96孔 PCR 反应板或相应量的 8联管、 PCR 单管。4. 光学级封板膜或相应封板耗材校正操作准备用户必须准备三块 96孔 PCR 反应板来进行不同的校正操作。恒定孔间差异因子校正准备:1. 用蒸馏水把 10×内部孔间差异因子校正工作液稀释为 1×的浓度。2. 在第一块 96孔板中加稀释过的工作液。注意要每孔都加,且都要加一样的 量。3. 用封板膜将加完样的板封起来。本底校正准备:除用工作液不同外,第二块板也象上文那样操作。纯染料校正板准备:1. 在第三块 96孔板上,取一种染料校正液,

35、加一列 8孔,每孔同一体积。2. 其他种类的染料校正液也每样加一列 8孔。3. 用封板膜将加完样的板封起来。2.3.2掩模对准在进行掩模对准前,先做好以下工作:1. 按上文所示,准备好一块恒定孔间差异因子校正板。2. 把该板放入仪器内。3. 在软件上切换到“ Calibration ”模块的“ Mask ”界面。掩模对准操作步骤:1. 点击“ Home ”键。2. 点击“ Filter Position”栏的“ 3”键。3. 点击“ Take an Exposure”键。4. 点击“ Show Mask”键。5. 如果图象中出现粉红色象素点,降低暴光时间,重复步骤 34,直到没有粉 红色象素点

36、出现。6. 点击“ Optimize Mask”键。7. 点击“ Save Mask”键。2.3.3本底校准在进行本底校准前,先做好以下工作:1. 按上文所示,准备好一块本底校正板。2. 必须先完成掩模对准。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到“ Calibration ”模块的“ Background ”界面。本底校准操作步骤:1. 选择一种封板类型。2. 选择一种反应容器类型。3. 点击“ Collect Background Factor”键。4. 当软件完成校准分析后,会弹出一个对话框“ Background Calibration Run Complete ”。5. 点击“

37、OK ”键退出。2.3.4恒定孔间差异因子的检测在恒定孔间差异因子的检测前,先做好以下工作:1. 按上文所示,准备好一块恒定孔间差异因子校正板。2. 必须先完成掩模对准和本底校准。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到“ Calibration ”模块的“ Well Factor”界面。恒定孔间差异因子的检测操作步骤:1. 选择对应的样品体积。2. 选择一种封板类型。3. 选择一种反应容器类型。4. 点击“ Collect Persistent Well Factors”键。5. 当软件完成分析后,会弹出一个对话框“ Persistent Well Factor Calibration

38、Run Complete”。6. 点击“ OK ”键退出。2.3.5纯染料校正在纯染料校正前,先做好以下工作:1. 按上文所示,准备好一块纯染料校正板。2. 必须先确认其他三项校正已全部完成。3. 把该板放入仪器内。4. 在软件上切换到“ Calibration ”模块的“ Pure Dye”界面。纯染料校正操作步骤:1. 创建一个新的纯染料校正反应板设置文件或选择一个已有的设置文件。2. 点击“ Run Pure Dye Calibration”键。3. 当软件完成分析后,会弹出一个对话框“ Pure Dye Calibration Run Complete ”。4. 点击“ OK ”键退出

39、。至此,所有的校正操作全部完成。注意:SYBR 和 SYBR1-5都不需要进行校正。3. iQ5软件操作说明3.1 综述iQ5软件系统分为 4个部分, 我们称之为 4个模块。 每个模块对应不同的功能。 在软件界面的左半部有对应的 4的切换键, 用户可以通过它们来进出各模块 (注 意,刚打开软件时,有些模块切换键呈灰色,不可选。这四个模块分别是:Workshop 模块:用户可在这个模块中创建、修改反应程序文件和反应板设置文 件,还可以以当前的设置运行反应。该模块分为“ Setup ”和“ Plate Summary” 两个窗口,“ Plate ”、“ Protocol ”、“ Run Set”和

40、“ Data File”四个界面。 Run-Time Center模块:该模块的功能在于实时监测反应运行状况。 Data Analysis模块:该模块的功能是实验数据的分析。在这个模块中,用户可 以对数据进行 PCR 定量、熔点温度、基因分型、基因表达等多项分析。 Calibration 模块:在这个模块中,用户可以对仪器的光学系统进行校正。 3.2 Workshop模块3.2.1 综述“ Workshop ”模块由“ Setup ”和“ Plate Summary”两个窗口组成。3.2.1.1 Setup窗口“ Setup ” 窗口是“ Workshop ”模块的默认打开窗口。 该窗口含有

41、4个界面:Protocol :这部分界面负责 PCR 热循环反应程序相关操作。Plate :这部分界面负责反应板设置文件相关操作。Run Set:这部分选择反应所对应的反应程序文件和反应板设置文件。 Data File:这部分可以选择打开已有的数据文件。Setup 界面组成及各功能键:“ Setup ”窗口分为四个部分。文件浏览器:处于窗口的左上部。 用户可以在其中通过路径树找到想要选择的各 种文件。 里面有 4个切换键, 点击一键, 那么浏览器里只能选择与之对应的文件 类型。Protocol 切换键:点击该键后,浏览器里可选择的文件类型为反应程序文件,后 缀为 .tmo 。Plate 切换键

42、:点击该键后,浏览器里可选择的文件类型为反应板设置文件,后 缀为 .pts 。Run 切换键:点击该键后, 浏览器里可选择的文件类型为反应运行设置文件 (其 实为反应用反应程序文件和反应板设置文件的一个连接性文件,后缀为 .run 。 Data File切换键:点击该键后,浏览器里可选择的文件类型为反应数据文件, 后缀为 .opd 。Selected Protocol区:该区位于窗口的左下部, 显示在文件浏览中选择的反应程 序文件的具体内容, 分为曲线图和列表。 其上方显示当前反应程序文件的文件名。 如果用户在文件浏览器中选择了一个反应数据文件, 那本区显示为该数据文件对 应的反应程序文件。S

43、elected Plate Setup区:该区位于窗口的右下部,显示在文件浏览中选择的反 应板设置文件的具体内容。 其上方显示当前反应板设置文件的文件名。 如果用户 在文件浏览器中选择了一个反应数据文件, 那本区显示为该数据文件对应的反应 板设置文件。Selected Data File区:该区位于窗口的右上部,显示在文件浏览中选择的反应 数据文件的相关内容。在“ Notes ”栏中显示对该数据文件的说明。其中有三个 功能键。Run 键:点击该键后, 会以当前的反应程序文件和反应板设置文件开始一次反应。 Run End Point键:点击该键后,会开始一次终点法反应。Analyze 键:点击该

44、键后,会切入“ Data Analysis”模块对当前数据进行分析。3.2.1.2 Plate Summary窗口这个窗口会显示更详细的反应板设置文件的内容, 比如用户对每个样品属性的注 释和标准品含量等等,这将会为用户检查文件设置正确与否提供方便。如果用户在“ Setup ”窗口中打开了一个反应数据文件,那么本窗口显示的将会 是与其对应的反应板设置文件。 用户可以点击窗口左上各荧光染料切换键来选择显示不同荧光染料对应的设置 内容。点击“ Copy To Clipboard”键会将显示的表格复制到剪贴板上,并可以粘贴到 其他文档中去。点击“ Print ”键可将显示表格打印出来。3.2.2 反

45、应板设置文件3.2.2.1 综述在“ Workshop ”模块中可以对反应板设置文件的各项具体内容进行设置,包括 样品类型、标准品含量、荧光染料类型等等。用户还可以直接导入一个 CSV 文 件来注释每个样品。选择一个反应板设置文件:在“ Workshop ”模块中按此法打开一个反应板设置文件。1. 点击“ Plate ”切换键,在浏览器中找到文件储存路径。注意:如打开一个反应数据文件,其对应的反应板设置文件也会显示。 2. 点击其文件名,此时 Selected Protocol区会显示其具体内容。此时各孔默认的显示第一种荧光染料对应的样品类型。 用户可以点击左上的荧光 染料切换键来显示不同荧光

46、染料的相关内容。上方“ Sample Volume”显示的是反应体积, “ Seal Type”显示的是封板模式, “ Vessel Type”显示的是反应容器类型。 如果用户在反应结束后修改过反应板设置文件,那么点击右上方的“ Original ” 选项可以显示原始未修改过的文件,点击“ Current ”选项显示修改过的文件。 在这个显示界面中,是无法对文件中任何内容进行修改的。创建或修改一个反应板设置文件修改一个反应板设置文件1. 如上文所述,选择一个反应板设置文件。2. 点击“ Edit ”键,进入反应板设置修改器。用户也可以直接在选择反应板设 置文件时候双击文件名进入。3. 修改完成

47、后,点击“ Save & Exit Plate Setup”键保存退出。4. 在“ Plate Summary”窗口确认修改的内容是否正确。创建一个反应板设置文件1. 点击“ Selected Plate Setup”区的“ Create New”键,进入反应板设置修 改器。2. 设置完成后,点击“ Save & Exit Plate Setup”键保存退出。3. 在“ Plate Summary”窗口确认修改的内容是否正确。3.2.2.2 反应板设置修改器反应板设置修改器主体是一个 96孔反应板模拟图,并有一些功能键来实现样品 类型、荧光染料种类等的设置。而下方的列表中也详细

48、显示了各孔的注释内容。 还有两个界面可以显示设置具体内容:1. “ Plate Summary”窗口。2. 点击反应板设置修改器的“ Spreadsheet ”键,其显示的列表也显示其设置 具体内容。退出反应板设置修改器如用户点击“ Cancel & Exit Plate Setup”键,则取消一切修改内容,退出修改 器。如用户点击“ Save & Exit Plate Setup”键,则保存一切修改内容,退出修改器。 注意:用老版本软件建立的 .pts 文件也可以修改, 但必须添加反应容器类型和封 板模式相关内容才能保存反应板设置文件修改步骤:1. 在 Workshop 模块

49、中,用户可以:a. 点击反应板设置文件显示区的“ Create New”键创建一个新的反应板设 置文件;b. 点击反应板设置文件显示区的“ Plate ”键,在浏览器中选择想要的反应 板设置文件的路径并双击其文件名,即可选中该文件;c. 点击反应板设置文件显示区的“ Plate ”键打开浏览器,选择想要的反应 板设置文件的路径并双击其文件名,再点击“ Edit ”键即可对该文件进行 修改;d. 点击“ Data File”键,在随后出现的浏览器中选择数据文件。点击其文 件名即可打开其关联的反应板设置文件,再点击“ Edit ”键即可对其进行 修改。2. 在“ Notes ”栏中输入或修改对该文

50、件的说明。3. 在样品体积 (Sample Volume 、 封板类型 (Seal Type 、 反应容器类型 (Vessel Type 各项设置中输入或修改相应内容。4. 输入或修改文件名。5. 点击 “ Select/Add Fluorophores” 键选择本次实验所要使用的荧光染料种类, 在软件中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。6. 如果“ Whole Plate Loading”显示在取消状态,请选择该选项选项。注意当 用户修改一个反应板设置文件时,该选项为不可用。7. 点击某一样品类型图标。8. 用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。9. 点击某一荧光染料图标。10.

51、 用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。11. 重复以上 78两个步骤,直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部 设置完毕。12. 如要取消某孔此前的所有设置,点击“ Delete All”键,再点击该孔。13. 如要取消某孔此前的荧光染料设置,点击“ Delete Fluorophore”键,再点击 该孔。14. 如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard ,点击 “ Dilution Series”键可设置其原始靶核酸数量。以上为所有反应板设置文件共通的部分, 根据反应板设置文件对应类型不同, 以 下的步骤有所区别。a. 单色荧光检测(Single-Colo

52、r Experiments15. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。b. 多色荧光检测并启用 “ Whole Plate Loading” 选项 (Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Seleted15. 点击第二荧光染料对应的图标。16. 如要取消当前选择的第二荧光染料,点击“ Delete Fluophore”图标并点击 相应反应孔。17. 点击“ Paint Can”图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应

53、的反应孔。19. 重复 78两个步骤,直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置 完毕。20. 重复 1519的步骤,把第三、第四荧光染料设置完毕(如有需要 。21. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。c. 多色荧光检测并不启用 “ Whole Plate Loading” 选项 (Multi-Color Experiments with Whole Plate Loading Deseleted15. 点击第二荧光染料对应的图标。 此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会 显

54、示, 但其样品类型不会显示。 同样在设置第三及第四荧光染料时, 此前的 荧光染料对应的样品类型也不会显示。 16. 如要取消当前选择的第二荧光染料,点击“ Delete Fluophore”图标并点击 相应反应孔。17. 点击某一样品类型图标。18. 用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。19. 重复 1718两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。20. 如要某些反应孔第二荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard ,点击 “ Dilution Series”键可设置其原始靶核酸数量。21. 重复 1520的步骤,把第三、第四荧光染料设置完毕(如有需要 。22

55、. 点击“ Save & Exit Setup”键,在随后出现的对话框中设置文件名并进行保 存。该文件会以后缀为“ .pts ”的文件形式保存。3.2.2.3 样品类型图标在 96孔模拟图的上方有 9种不同样品类型的图标,用户通过这两者来定义不同 反应孔的样品类型。 当一个图标被红框框住时, 代表此样品类型为当前选择的样品类型。 各图标代表 意义如下: 该光标可以选择反应孔,但不能改变其属性。 该光标用于定义标准品。 该光标用于定义未知样品。 该光标用于定义阴性对照。 该光标用于定义阳性对照。 油漆桶状光标,当点击该光标再点击某一样品群中的某一孔时候,该样 品群其他所有样品类型均会与该

56、孔相同。 点击该光标再点击某一反应孔,那么这个反应孔对应当前荧光染料的样 品类型设置将会被删除。 点击该光标再点击某一反应孔,那么这个反应孔对应所有荧光染料的样 品类型设置将会被删除。3.2.2.4 选择 /添加荧光染料在 iQ5中, 每个反应孔至少要设置一种荧光染料。 一块反应板最多可以设置五 种不同的荧光染料,且这五种荧光染料可以设置在一个反应孔里。在 iQ5软件设置中, 用户可以在一次反应中同一荧光滤镜组中设置对应五种不 同荧光染料。比如用户在一块反应板中些孔用 SYBR ,有些孔用 FAM (这两者所对应的荧光滤镜组相同 。 但是这种类型的荧光染料不能设置在一个反应孔里, 否则检测时无

57、法分辨。 点击 “ Select/Add Fluorophores”键, 在随后出现的文件框中可以选择添加其他 荧光染料。点击其中的“ Select ”栏打上“”,代表该荧光染料已被选择,再 点一下 “”消失,则代表取消选择。选择好后点击“ OK ”键即可完成添加。 如用户需要的荧光染料未在该文件框中出现,则可点击“ Add New Fluor”键, 自行添加,当然使用前必须进行一次纯染料校正。3.2.2.5 设置样品群在 96孔模拟图左侧有一些功能键可用于定义样品群。 系统默认的定义方式。先点击该键,然后可按下列各法进行操作。点击一个反应孔,既代表该孔被选入样品群。点击一行或一列头上的序号,则代表该行或该列所有的孔都被选入样品群。 在模拟图上按住鼠标左键进行拖曳,拖曳区域内所有