分子生物学第二章DNA的复制

1、DNA 的复制的复制 DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。型。DNA的复制、转录和翻译过程就构的复制、转录和翻译过程就构成了成了遗传学的中心法则遗传学的中心法则。 RNA病毒的遗传信息贮存在病毒的遗传信息贮存在RNA分子分子，遗传信息的流向是遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；通过反转录传信息由亲代传递给子代；通过反转录将遗传信息传递给将遗传信息传递给DNA，再由，再由DNA通过通过转录和

2、翻译传递给蛋白质，这种遗传信转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了息的流向就丰富了中心法则的内容中心法则的内容。 中心法则中心法则Crick于于1954年所提出的遗传信息传递规律年所提出的遗传信息传递规律1954年首次年首次提出的提出的“中心法则中心法则” 1970-1980年年的的“中心法则中心法则” 21世纪后修正世纪后修正的的“中心法则中心法则” 一一. DNA复制概况复制概况 DNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNA的每一条单链的每一条单链DNA作模板，作模板，合成完全相同的两个双链子合成完全相同的两个双链子代代DNA，每个子代，每个子代DNA中都中都含有一条亲代含有一

3、条亲代DNA.这种现象这种现象称 为称 为 D N A 的 半 保 留 复 制的 半 保 留 复 制 ( s e m i - c o n s e r v a t i v e replication)。 DNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在1958年年由由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的实验所完成的实验所证明。所证明。2、实验证据（1958 Meselson 和Stahl ）： Matthew Messelson Franklin Stahl复制叉与复制子 DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子(replicon)。 一

4、个复制子只含一个复制起点。复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，复制起点呈叉子形式，被称为复制叉(Replication fork)。复制叉（复制叉（Replication forkReplication fork）：）： DNADNA复制时在复制时在DNADNA链上通过解旋、解链和链上通过解旋、解链和SSBSSB蛋白的结合等蛋白的结合等过程形成的过程形成的Y Y字型结构称为字型结构称为复制叉复制叉. .复制叉复制叉复制叉复制叉部分生物复制子的比较从复制原点到终点，组成一个能够独立进行复制的从复制原点到终点，组成一个能够独立进行复制的DNADNA复复制单位叫复制子制单位叫复制子复制子

5、复制子 ：原核生物只有一个复制原点，整个染原核生物只有一个复制原点，整个染色体只有一个复制单位。色体只有一个复制单位。真核生物有多个复制起始点，真核生物有多个复制起始点，因此是多复制子。因此是多复制子。每个复制子在每一次细胞循环中只启动一次。每个复制子在每一次细胞循环中只启动一次。 DNA复制是从复制是从DNA分子的特定位置开始的，这一位分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点（复制起始点）（大肠杆菌用置叫复制原点（复制起始点）（大肠杆菌用ori表示，表示，酵母酵母ARS）。是由一些具有特定核苷酸排列顺序的）。是由一些具有特定核苷酸排列顺序的片段组成。富含片段组成。富含A-T。 在原核生物中，

6、复制起始点通常为一个，而在真核在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。生物中则为多个。 复制起点复制起点DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。 双向复制双向复制 真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。 细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的；原核生物DNA的复制双向复制( Bidirectional Replication ) 无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。 复制叉以DNA分子上某一

7、特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。DNA Synthesis 由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是53方向，另一条是35方向，两个模板极性不同。 所有已知DNA聚合酶的合成方向都是53， 为了解释DNA的等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等提出了DNA的半不连续复制模型（semi-discontinuous replication）。半不连续复制Semi-discontinuous replication冈崎片段前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制。3H Thymidinepulse-ch

8、ase labeling and alkaline sucrose gradient: discovery of semi-discontinousreplication用3H脱氧胸苷短时间标记后提取DNA，得到不少平均长度为2-3kb DNA片段。用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量小片段累积，说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再生成大分子DNA。由于由于DNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA链链，即，即模板模板DNA链链的方向必须的方向必须为为35。因此，分别以两条亲代。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代

9、链作为模板聚合子代DNA链时的方式是链时的方式是不同的。不同的。DNA的半不连续复制的半不连续复制 以以35方向的亲代方向的亲代DNA链作模板的子代链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为链的聚合方向为53，这一条链被称为，这一条链被称为前导链前导链(leading strand)。 以以53方向的亲代方向的亲代DNA链为模板的子代链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是向也是53，这条链被称为，这条链被称为滞后链滞后链(lagging strand)。 由于亲代由于亲代DNA双链在

10、复制时是逐步解开双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。的。DNA在复制时，由滞后链所形成的在复制时，由滞后链所形成的一 些 子 代一 些 子 代 D N A 短 链 称 为短 链 称 为 冈 崎 片 段冈 崎 片 段(Okazaki fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中个核苷酸，而在真核生物中约为约为100个核苷酸。个核苷酸。 二二. 参与参与DNA复制的酶复制的酶双螺旋双螺旋DNA复制是复制是DNA聚合酶催化的酶促反聚合酶催化的酶促反应过程。应过程

11、。DNA聚合酶只能延长已有的聚合酶只能延长已有的DNA或或RNA引物链，不能从头起始引物链，不能从头起始DNA链的合成链的合成；在复制叉结构区内，在复制叉结构区内，DNA双螺旋中的两条链双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺双螺旋旋DNA解旋并释放或吸收由此产生的扭力解旋并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成，DNA聚合酶不能完成这一过程聚合酶不能完成这一过程;在不连续合成中形成在不连续合成中形成短的冈崎片段的连接也短的冈崎片段的连接也是是DNA聚合酶无法完成聚合酶无法完成的。

12、的。 DNADNA旋转酶旋转酶( (拓扑异构酶）拓扑异构酶）； 使使DNADNA双股链在复制叉解开的双股链在复制叉解开的解旋酶解旋酶； 在在DNADNA复制前防止解开的复制前防止解开的DNADNA单链局部退火单链局部退火的的DNADNA结合蛋白结合蛋白； 合成合成RNARNA引物的酶引物的酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使冈崎片段共价连接的使冈崎片段共价连接的DNADNA连接酶连接酶1、DNA聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶种类和生理功能：种类和生理功能： 在原核生物中，已发现的在原核生物中，已发现的DNADNA聚合酶有五种，聚合酶有五种，分别命名为分别命名为DNADNA聚合酶

13、聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚 合 酶聚 合 酶 （ p o l p o l ） ，） ， D N AD N A 聚 合 酶聚 合 酶 （polpol），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。 前三种酶都属于具有多种酶活性的多功能前三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与酶。参与DNADNA复制的主要是复制的主要是polpol和和polpol。 参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一段具聚合酶，必须以一段具有有3端自由羟基端自由羟基（3-OH）的）的RNA作为引物作为引物(primer) ，才能开始聚合

14、子代，才能开始聚合子代DNA链。链。1. RNA引物的大小，通常为引物的大小，通常为110个核苷酸。个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基的碱基顺序相配对。顺序相配对。 RNA引物引物 pol为单一肽链的大分子蛋白质为单一肽链的大分子蛋白质,可被特可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为片段称为Klenow fragment，具有，具有53DNA聚合酶聚合酶活性和活性和35外切酶外切酶的的活性。活性。 Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs a

15、nd one for removal of the mispaired dNTP. binds to two metal ions that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis. (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides by forming extensive hydrogen bond contacts with minor groove o

16、f the newly synthesized DNA. Exonuclease site/proof reading site Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis Bends the template to expose the only nucleotide at the template that ready for forming base pair with the incoming nucleotide Stabilization of

17、the pyrophosphate Not directly involved in catalysis Interacts with the synthesized DNA to maintain correct position of the primer and the active site, and to maintain a strong association between DNA Pol and its substrate. pol 由十种亚基组成，其中由十种亚基组成，其中亚基具有亚基具有53 DNA聚合酶活性，因而具有聚合酶活性，因而具有复制复制DNA的功能；而的功能；而亚

18、基具有亚基具有35外切酶外切酶的活性，因而与的活性，因而与DNA复制的复制的校正校正功能有功能有关。关。 DNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repair)。 当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。 原核生物中的三种原核生物中的三种DNA聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 5 533聚合酶活性聚合酶活性 + + + + + + 5 533外切酶活性外切酶活性 + + - -

19、- - 3 355外切酶活性外切酶活性 + + + + + + 生理功能生理功能 去除引物去除引物, ,填补缺口填补缺口 未知未知 DNA DNA 复制复制 修复损伤修复损伤 校正错误校正错误 校正错误校正错误 在真核生物中，目前发现的在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶聚合酶有五种，分别命名为有五种，分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol），），DNA聚合聚合酶酶（pol），），DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol）。）。 参与染色体参与染色体DNA复制的是复制的是pol（延长滞（延长滞后链）后链）和和pol（延长前导链），参与线（

20、延长前导链），参与线粒体粒体DNA复制的是复制的是pol，pol与与DNA损损伤修复、校读和填补缺口有关，伤修复、校读和填补缺口有关，pol只只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。在其他聚合酶无活性时才发挥作用。 DNA复制的保真性：复制的保真性：为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有的复制必须具有高保真性。高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列复制时的保真性主要与下列因素有关：因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正。对复制过程中出现的错误

21、及时进行校正。 2、DNA解旋酶和单链结合蛋白解旋酶和单链结合蛋白复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解旋酶（DNA helicase）和单链DNA结合蛋白（single-strand binding protein, SSB）。DNA解旋酶是很多细胞过程所要求的（如核苷酸切除修复、同源重组、转录终止）。DNA解旋酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解链酶）。解

22、链酶的作用示意图解链酶的作用示意图单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白行使很多涉及单链区域稳定性的功能。SSB与DNA单链相结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。SSB与DNA结合时有协同作用，当一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白聚合体。 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding protein, SSB）的作用为：）的作用为：

23、使解开双螺旋后使解开双螺旋后的的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 3、拓扑异构酶拓扑异构酶 天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA旋转酶去除解螺旋酶的解链产生的扭曲张力。 大肠杆菌中的DNA旋转酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase），超螺旋：DNA双螺旋链再盘绕即形成的空间结构 （1）正超螺旋(positive supercoil)：

24、盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 （2）负超螺旋(negative supercoil)： 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 正超螺旋：两股以右旋方向缠绕的螺旋，在外力往紧缠的方向捻转时，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外力捻转造成的胁变。这样形成的螺旋为正超螺旋。 负超螺旋：两股以右旋方向缠绕的螺旋在外力向松缠的方向捻转时，产生一个右旋的超螺旋以解除外力捻转造成的胁迫。这样形成的超螺旋为负超螺旋. 正超螺旋 负超螺旋 天然DNA分子一般为负超螺旋 负超螺旋DNA更易于局部解链，易于参加DNA的复制、转录等拓扑异构酶拓扑异构酶oror溴化乙锭溴化乙锭拓扑异构酶拓扑异构酶oror溴化乙锭溴化乙锭DNA

25、DNA扭曲与双螺扭曲与双螺旋相同（拧紧）旋相同（拧紧）DNADNA扭曲与双螺扭曲与双螺旋相反（松开）旋相反（松开）负超螺旋负超螺旋松弛松弛DNADNA正超螺旋正超螺旋3、拓扑异构体（Topological isomer）： 具有不同连接数的相同DNA分子4、拓扑异构酶（Topoisomerase）： 能够改变DNA连接数从而改变DNA分子超螺旋水平的酶（1）拓扑异构酶I （topoisomerase- I ） 作用机制：切开环状一条链，连接数改变1，不需ATP （2）拓扑异构酶 作用机制：切开环状两条链，连接数改变2，需要ATP 结合到结合到一条链一条链上形成上形成复合物复合物切断一切断一条链

26、形条链形成酶和成酶和蛋白的蛋白的复合体复合体共价连接共价连接 Tyrosine-5PTyrosine-5P一条链一条链穿越穿越重新重新连接连接L=2L=2L=3L=3 拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase I) (topoisomerase I) 拓扑异构酶拓扑异构酶Top II Top II 引入负超螺旋引入负超螺旋作用于双链：涉及双链的断裂和连接每次使作用于双链：涉及双链的断裂和连接每次使DNADNA的连接数改变的连接数改变2 2 DNA拓扑异构酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA旋转酶的催

27、化功能。 当加入DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA旋转酶是DNA复制所必不可少的。4、引发酶与引物、引发酶与引物RNA的合成的合成 DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为110个核苷酸。催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺序，以核

28、糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA（如mRNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。RNA引物必须去除以完成引物必须去除以完成DNA复制！复制！RNase HDNA polymeraseDNA ligase5、DNA连接酶连接酶 DNA DNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)可催化两段可催化两段DNADNA片段之间片段之间磷酸二酯键磷酸二酯键的形成，而使两段的形成，而使两段DNADNA连接起来。连接起来。 DNA连接酶催化的连接酶催化的条条件件 是 ：是 ： 需 一 段需

29、一 段DNA片段具有片段具有3-OH，而另一段而另一段DNA片段具片段具有有5-Pi基基； 未封闭未封闭的缺口位于双链的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链中，即其中有一条链是完整的是完整的； 需要消需要消耗能量，在原核生物耗能量，在原核生物中由中由NAD+供能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATP供供能。能。三、DNA 复制过程 复制的起始(initiation) DNA链的延伸(elongation) 复制的终止(termination)1. DNA复制的起始 复制起始原点 DNA双螺旋的解旋 复制的引发DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链，那么，新DNA的复制

30、是怎样开始的呢？大肠杆菌(E. coli)的OriC复制原点参与DNA复制起始和引发的蛋白质 DNA解旋酶(DNA helicase)催化DNA双链的解链过程。 单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein)：以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。 DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)消除DNA双链的超螺旋堆积。 引物酶(primase)合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3-OH末端。2. DNA链的延伸DNA链的延伸需要的蛋白质: DNA聚合酶 滑动夹（Sliding DNA clamp） RNA

31、酶(RNaseH 等) 在复制完成后切除RNA引物。 DNA连接酶(DNA ligase)通过生成35-磷酸二酯键连接两条DNA链。DNA polymerase catalyze DNA synthesisDNA Structureof a sliding DNA clamp Sliding DNA clamps encircle the newly replicated DNA produced by an associated DNA polymerase. Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity(持

32、续合成能力) Removal of RNA primers from newly synthesized DNARNA引物的切除引物的切除3. 复制的终止 当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。四四. DNA复制的几种主要方式复制的几种主要方式 DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段，该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequently open

33、ing region），由此产生的瞬时单链与SSB蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。根据DNA合成的起始方式，复制可分为重新起始与共价延伸两种类型：前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式滚环式复制复制。复制主要以双向等速双向等速进行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的复制；部分是单方单方向进行向进行，如质粒ColE1的复制；或以不对称的双向方式进行，如线粒体DNA的复制。1、复制叉式复制、复制叉式复制(一一)、复制的起始、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步

34、构成。复制的起始阶段，由下列两步构成。 1、预引发：、预引发： （ 1）解旋解链，形成复制叉：）解旋解链，形成复制叉： 由由拓扑异构酶和解链酶拓扑异构酶和解链酶作用，使作用，使DNA的超的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链形成两条单链DNA。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白结结合在两条单链合在两条单链DNA上，形成上，形成复制叉复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为这种叉状结构称为复制叉复制叉。对于双向复制而。对于双向复制而言，形成的言，形成的两个复制叉向相反方向行进两个复制

35、叉向相反方向行进，每，每个复制叉上的两条个复制叉上的两条DNA链均被拷贝。链均被拷贝。（2）引发体组装：）引发体组装： 由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成组装形成引发体引发体。2、引发：、引发：在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA为模板，合为模板，合成一段短的成一段短的RNA片段，从而获得片段，从而获得3端自端自由羟基（由羟基（3-OH）。）。 （二）、复制的延长（二）、复制的延长 1 1、聚合子代、聚合子代DNADNA：由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方

36、向的亲代方向的亲代DNADNA链为模板，从链为模板，从5353方向聚合子代方向聚合子代DNADNA链。链。在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNADNA复制延长的是复制延长的是DNADNA聚合聚合酶酶；在真核生物中，在真核生物中，是是DNADNA聚合酶聚合酶(延长滞延长滞后链后链) )和和DNADNA聚合酶聚合酶（延长前导链）。（延长前导链）。2、引发体移动：、引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成形成新的复制叉，滞后链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。引物，继续进行链的延长。 （三）、复制的终止（三）、复制的终

37、止 去除引物，填补缺口：去除引物，填补缺口：在原核生物中，由在原核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶来水解去除来水解去除RNARNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNADNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。在真核生物中，在真核生物中，RNARNA引物的去除，由一种特引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNADNA聚聚合酶来延长。合酶来延长。 连接冈崎片段：连接冈崎片段：在在DNA连接酶连接酶的催化下，形成最后一的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形个磷酸酯键

38、，将冈崎片段连接起来，形成完整的成完整的DNA长链。长链。 The composition of the DNA Pol III holoenzyme2、滚环式复制、滚环式复制 型复制是双链环状DNA以复制叉方式进行复制的特例。某些双链环状DNA或单链DNA的复制型（replication form, RF），在复制时，以滚环复制方式进行。 滚环复制是在一条断裂的亲本链的3-OH端不断地发生DNA聚合作用，因而又称共价延伸。由于断开的3-OH端仍然与其互补链形成双螺旋结构，因而没有合成RNA引物的必要。合成先导链的模板也总是呈环状。 滚环复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNA复制的共同方

39、式，E.coli噬菌体（如X174、M13）的环形双螺旋DNA复制时，仅仅以1条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝； 某些双链DNA的合成也可以通过滚动环的复制方式进行，例如，噬菌体复制的后期以及真核生物如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA基因的扩增都是以这种方式进行的。 Rolling circles produce multimersof a replicon线粒体线粒体DNA的的D-噜噗复制噜噗复制 双链环状DNA中的一条前导链已经引发并开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲本链则被前导链置换出来成为单链状态。这种由一条单链和一条双链组成的三元泡状结构，叫做置换噜噗或D-噜噗（displa

40、cement loop）。只有前导链将另一条亲本链（即滞后链的模板）的特别序列置换出来成为单链形式，才能产生滞后链前体的引发并合成其互补链。DNA复制的不同方式 3 3、真核生物端粒的形成：、真核生物端粒的形成： 端粒端粒（telomeretelomere）是指真核生物染色体）是指真核生物染色体线性线性DNADNA分子末端的结构部分，通常膨大分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富成粒状。其共同的结构特征是由一些富含含G G、C C的短重复序列构成，可重复数十的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。次至数百次。 端粒结构 Telomeres 端粒是线状染色体末端的DNA重

41、复序列。 端粒是线状染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。把端粒当作一件绒线衫袖口脱落的线段，绒线衫像是结构严密的DNA，排在线上的DNA决定人体性状。 与人头发的直与曲，眼睛的蓝与黑，人的高与矮等等，甚至性格的暴躁和温和有关。原核生物的末端问题在原核生物中： 如果是环状的DNA双链双向复制，RNA引物切除后不管是前导链还是滞后链都可以通过3末端的延伸首尾相连把GAP补上（如大肠杆菌）；不存在末端问题 如果是线状的DNA双链，会在复制时从线状转换成环状或发夹结构来避开末端复制的问题（如T4噬菌体和草履虫的线状线粒体DNA）。 在真核生物中： 对于前导链来说，因为

42、真核生物的复制是从复制叉向两个方向复制的，前导链的切去的RNA的部分，可以被复制叉另外一个方向的后随链补平，不存在末端问题 而对于滞后链来说，其5端就是通过端粒酶来完成末端复制了。 真核生物的末端问题只有后随链才有末端问题，前导链不存在末端问题，为什么？端粒的结构与功能 1972年James Watson提出了“复制末端问题”，复制DNA的DNA多聚酶并不能将线性染色体末端的DNA完全复制。也就是说在线性DNA复制时，DNA多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段端粒）不复制。 端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中，每条染色体的3端均有一段DNA无法得到复制，随着细胞每次分裂，染色体3一末端

43、将持续丧失50-200bp的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分裂时钟”，反映细胞分裂能力。 端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆转录酶（TERT） 端粒酶结合蛋白（TEP） 端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白（端粒酶结合蛋白（TEPTEP）端粒酶端粒酶RNARN

44、A是第一个被克隆的端粒酶是第一个被克隆的端粒酶组分。端粒酶组分。端粒酶RNARNA含有与同源端粒含有与同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互补序列的互补序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板区切割此模板区, ,能使体外消除端粒酶能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。延长端粒的功能。人类人类TERTTERT（hTERThTERT）基因为一单拷贝基因）基因为一单拷贝基因, ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T T。破坏破坏TERT TERT 将消除端粒酶活

45、性并致端粒缩短。将消除端粒酶活性并致端粒缩短。TEP1TEP1、生存动力神经细胞基因、生存动力神经细胞基因(SMN) (SMN) 产物、产物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p 线性线性DNADNA在复制完成后，其末端由于引在复制完成后，其末端由于引物物RNARNA的水解而可能出现缩短。故需要的水解而可能出现缩短。故需要在在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，进）的催化下，进行延长反应。行延长反应。 端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-RNA-蛋白质蛋白质复合体，它可复合体，它可以其以其RNARNA为模

46、板，通过为模板，通过逆转录逆转录过程对末过程对末端端DNADNA链进行延长。链进行延长。 端粒酶端粒酶(telomerase)的作用机制的作用机制转转 座座 TranspositionDNA的转座的转座基本概念：转座子最先由转座子最先由Barbara Barbara McClintockMcClintock于于2020世纪世纪4040年代在玉米遗传学年代在玉米遗传学研究时发现的。研究时发现的。DNADNA的转座的转座：由可移位因子介导的遗传物质重排现象。：由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子转座子（transposon, Tntransposon, Tn）是存在于染色体）是存在于染色体D

47、NADNA上可自主上可自主复制和移位的基本单位。复制和移位的基本单位。 转座子存在于所有生物体内，人类基因组中有约35%以上的序列为转座子序列，其中大部分与疾病有关。转座子分为两大类：1. 1. 转座子的分类和结构特征转座子的分类和结构特征1 1. . 插入序列插入序列（insertional sequence, ISinsertional sequence, IS）2. 2. 复合型转座子复合型转座子（composite transposoncomposite transposon） 最简单的转座子，不含任何宿主基因。它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。 转座子常被定位到特定的基因，造成该基因突变。插入序列（插入序列（ISIS因子）因子）IS因子的特征：很小的DNA片段末端具有倒置重复序列 (反向互补)复制宿主靶位点DNA（4-15bp）可独立存在，带有介导自身移动的蛋白，可作为其他转座子的组成部分.特征：复合型转座子两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插到功能基因的两端就可能产生复合型转座子。复合型转座子复合型转座子是一类带有某些抗是一类带有某些抗药性基因（或其它宿主基因）的药性基因（或其它宿主基因）的转座子。转座子。复合型