牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究

1、牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究    【摘要】  目的通过牛蒡子苷对胰腺癌细胞株(CAPAN-1)体内外实验，验证其是否具有抗胰腺癌作用。方法在CAPAN-1细胞培养液中加牛蒡子苷，培养72 h并观察癌细胞的增殖抑制率及癌细胞形态变化。流式细胞仪（FCM）检测CAPAN-1细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测CAPAN-1细胞凋亡率；免疫细胞化学检测CAPAN-1细胞的增殖凋亡调控相关蛋白(bax、bcl-2)表达。用CAPAN-1细胞制作Balb/c裸小鼠荷瘤模型，连续每天腹腔注射牛蒡子苷（10 mg?kg-1?d-1）10

2、d，以5-FU（30 mg?kg-1?d-1）作阳性对照观察抑瘤率。结果牛蒡子苷抑制CAPAN-1细胞生长；阻滞CAPAN-1细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡；通过上调bax蛋白表达（P0.01），下调bcl-2蛋白表达（P0.05）诱导CAPAN-1细胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠肿瘤生长，抑瘤率为41.7%。结论牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。 【关键词】  牛蒡子苷； 抗肿瘤活性； 细胞凋亡； CAPAN-1细胞株    Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti-tumor effect an

3、d mechanism of arctiin on the human pancreas cancer cell (CAPAN-1) in vitro and vivo. MethodsCAPAN-1 cell was cultured in medium containing serial concentration of arctiin for 72 hours. Then the growth rate and the morphological change were analyzed. Cell apoptosis percentage was measured by TUNEL m

4、ethod and FCM. Cell cycle phase distribution was measured by FCM. The expression of proliferation and apoptosis associated proteins of bax,bcl-2 in CAPAN-1 cell were determined using immunocytochemistry. CAPAN-1 cell tumor-bearing nude mice were intraperitoneally administered arctiin and 5-FU and th

5、e tumor growth rate was observed.ResultsArctiin could inhibit proliferation of CAPAN-1 cell. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and apoptosis was induced（P0.05）. The onset of apoptosis was related to the up-regulation of bax protein（P0.01）and down-regulation of bcl-2 in protein level（P0.05）.

6、 Arctiin could inhibit the tumor growth, and inhibition rate was 41.7%.ConclusionThese studies suggest that arctiin can inhibit CAPAN-1 cells growth and one of mechnnisnms is to induce cell apoptosis.    Key words：Arctiin；  Anti-tumor effect；  Apoptosis；  CAPAN-1 cell l

7、ine    牛蒡子是具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的中药，且常用于抗癌方剂中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚A、B（lappaol A,B）、脂肪油等1。近来研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在动物体内实验中具有抗癌活性 24。牛蒡子苷对CAPAN-1细胞是否具有抑制作用尚无报道，为进一步研究牛蒡子苷的抗肿瘤活性，利用CAPAN-1细胞进行体内外实验，探讨牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用机理。    1    材料   

8、; 牛蒡子苷购于中国药品生物制品检定所；CAPAN-1细胞株由上海细胞研究所提供；FCS-1640细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（GIB Co）；SP免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl-2及bax单克隆抗体（Santa Cruz Co）。    2    方法    2.1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞生长的影响  取FCS-1640细胞培养液中对数生长期的CAPAN-1细胞3ml(细胞浓度约为6.5×103个?ml-1)，接种于直径35mm的培养皿中。随机分为用药组

9、和对照组。用药组分别加入用0.02%二甲亚砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg?ml-1；对照组加入0.02%二甲亚砜。每一浓度3个重复培养皿，培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数，设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率。    增殖率（%）=（用药组各时段癌细胞数用药组开始癌细胞数）/（对照组各时段癌细胞数对照组开始癌细胞数）×100%。    2.2   癌细胞形态学观察  倒置显微镜下动态观察培养皿中CAPAN-1细胞用药前后的变化。 

10、60;  2.3   FCM细胞周期检测    收集对照组和加牛蒡子苷1 g?ml-1的用药组培养24，48，72h的CAPAN-1细胞；PBS洗涤后，4下用75%酒精固定12 h以上；离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg?ml-1 RNA酶溶液150 l，37水浴30 min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龙网过滤后4下放置15 min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。    2.4   DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测细胞凋亡  在培养皿

11、中放置盖玻片，CAPAN-1细胞在盖玻片粘壁生长后，用药组加入1 g?ml-1牛蒡子苷，收集对照组和用药组培养24，48，72h附细CAPAN-1胞的盖玻片，按TUNEL试剂盒标记染色，结果判断：以细胞核内出现棕褐色为阳性。光镜下计算凋亡指数（Apoptotic index,AI）。AI是指每张TUNEL玻片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比。    2.5  免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax及bcl-2的蛋白表达  分别收集对照组和加牛蒡子苷1 g?ml-1的用药组培养48 h的CAPAN-1细胞，

12、用S-P法进行染色。小鼠bax单克隆抗体按1200稀释，bcl-2单克隆抗体按150稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断：细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数（labeling index，LI），重复3次，取均值。LI=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。百事通    2.6   荷瘤Balb/c裸小鼠肿瘤抑制实验  体重21 g左右的雌性Balb/c裸小鼠20只，于裸小鼠右侧腋窝皮下接种CAPAN-1细胞2×106 个（0.1 ml），接种后第8天随机分成对照组和用药组，每组

13、10只。牛蒡子苷组用牛蒡子苷10 mg?kg-1（用0.02%二甲亚砜溶解），阳性对照组用5-FU 30 mg?kg-1?d-1,对照组用0.02%二甲亚砜溶液，腹腔注射1次/d，连续10 d。移植肿瘤细胞第30天拉颈处死小鼠，切除肿瘤称重并按下面公式计算抑瘤率：    抑瘤率(%) = (1用药组平均瘤重/ 对照组平均瘤重)×100%。    2.7    资料统计分析  所有数据资料用SPSS统计软件分析处理，实验数据用±s表示，各组间比较用t检验。  

14、;  3  结果    3.1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞生长的影响  用药组与对照组相比CAPAN-1细胞数和增殖率减少，均呈浓度和时间依赖性（见图1及表1）。表1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞增殖率的影响    3.2   癌细胞形态学观察  在倒置显微镜下观察CAPAN-1细胞的生长情况，见用药组癌细胞数明显减少，细胞变小，折光性差，有的细胞破碎，随后脱落飘浮在培养液中。而对照组的癌细胞形态上无明显改变，生长良好。  

15、60; 3.3  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞周期和凋亡率的影响  FCM检测结果：用药组与对照组比较细胞周期阻滞在G0/G1期，并出现细胞凋亡（见表2）。TUNEL法检测结果：用药组与对照组比较细胞凋亡率增高，差异具有显著性意义，且随处理时间增加细胞凋亡率亦增加（见表3）。 表2  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞周期及凋亡的影响 表3  TUNEL法检测CAPAN-1细胞的凋亡率    3.4   牛蒡子苷对bax及bcl-2蛋白表达的影响  处理48 h后，与对照组相比bax标记指数LI增加（

16、t=38.09  P0.01，bcl-2标记指数LI降低（t=5.19  P0.05），见表4。表4  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞bax、bcl-2蛋白表达的影响 与对照组相比较，* P0.01  *，P0.05    3.5  牛蒡子苷对荷瘤Balb/c裸小鼠肿瘤抑制实验  牛蒡子苷组和阳性对照组裸小鼠平均瘤重小于对照组平均瘤重，差异具有显著性意义（t=5.89， t=12.42，P<0.01），阳性对照组裸小鼠平均瘤重小于牛蒡子苷组平均瘤重，差异具有显著性意义（t=5.89, t=12.42，

17、P<0.01）。见表5。表5  牛蒡子苷对荷瘤Balb/c裸小鼠瘤重和抑瘤率的影响    4  讨论    最近实验研究表明，牛蒡子苷在动物体内实验中具有抗肺癌，白血病活性。与5-FU、环磷酰胺及顺铂合用，可减少或阻止抗癌剂抗药性的增加，并能够抑制体外培养的肿瘤细胞对葡萄糖的利用58。本实验通过对胰腺癌细胞株（CAPAN-1）的体内和体外实验，以进一步证明牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性。    在利用牛蒡子苷对CAPAN-1细胞进行的体外实验中。牛蒡子苷能抑制CAPAN-1细胞的增

18、殖；通过观察CAPAN-1细胞的形态，观察到癌细胞生长被抑制；TUNEL标志法观察到CAPAN-1细胞凋亡；FCM检测CAPAN-1细胞周期和凋亡率结果显示，牛蒡子苷先将细胞周期阻滞于G0/G1期，然后诱导细胞凋亡。bax和bcl-2是一对凋亡相关调控基因，bax主要通过与其家族bcl-2形成二聚体而发生作用。当bcl-2表达较高时，bcl-2和bax形成异源二聚体而抑制凋亡；当bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡9。本实验结果表明，牛蒡子苷作用于CAPAN-1细胞后bcl-2基因表达减弱，bax基因表达增强，说明其可下调bcl-2及上调bax表达，这可能为牛蒡子苷诱导CAPA

19、N-1细胞凋亡的机理之一。从癌细胞体外实验中可得出牛蒡子苷能抑制体外培养的CAPAN-1细胞的生长，并诱导细胞凋亡。    在体外实验中，对癌细胞有抑制或杀伤作用的药物，在活体中由于各种综合因素的作用不一定仍具有抑制肿瘤的作用。为此进行了CAPAN-1细胞荷瘤裸小鼠肿瘤抑制实验。结果牛蒡子苷能够抑制荷瘤裸小鼠肿瘤的生长。但抑瘤率较5-FU弱，表明牛蒡子苷在活体上也具有抑制CAPAN-1细胞的活性。通过对CAPAN-1细胞的体内外实验，证明牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。【参考文献】  1 郭兰忠. 现代实用中药学，第1版M. 北京

20、: 人民卫生出版社，1999: 602.2 Takasaki M,Konoshima T,Komatsu K,et al. Antitumor-promoting activity of lignans from the aerial part of Saussurea medusalJ. Cancer Lett,2000,158(1): 63.3 Hwang Y K，Kim D C，Hang W I.,et al.Inhibitory Effect of Artemisia princeps Pampan. Extract on Growth of Cancer Cell LinesJ. K

21、orean J.Nutrition ,1998, 31（4）: 799.4 Yu Wei-ping,Wang Guo-zhen,Gao Lei,et al. In vitro growth inhibition effect of hepatocyte growth factor on SMMC-7721 human hepatocellular carcinoma cellsJ.Journal of southeast university(Medical Science Edition), 2002, 3:16.5 Hiano T, Goroh M, Oka K. Natural flavonoids and lignans poteat cytostatic agents against human leukemic HL-60 cellJ.Life sci,1994,55(13): 1061. 6 Hirose M,Yamaguchi T,Li