血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究

1、致谢 本文系国家自然科学基金资助项目 （ NO 90709014） 血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究韩晓菲a 黄宇虹b 王龙星a 杨乾栩a 肖红斌a * 张德芹b*（a中国科学院大连化学物理研究所 辽宁大连 116023 b天津中医药大学 天津 300193 ）摘要 本文目的是用代谢组学手段研究血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性。采用邻苯二甲醛（OPA）柱前在线衍生反相高效液相色谱法，建立了血浆中21种氨基酸代谢谱的相对定量分析方法。衍生由自动进样器在线自动完成，紫外检测器检测，流动相A为10mmol/L Na2HPO4- Na2B4O7 PH7.95缓冲液，B液为乙腈：甲醇：水 (体积比为45

2、:45:10)，二元线性梯度洗脱，流动相B在30min内由5%-46%，27min内21种氨基酸全部得到良好分离。用此方法测定了51位临床糖尿病人血浆氨基酸代谢谱。以相对峰面积作为原始数据，按血糖值高低预分组，通过spss和matlab软件平台，用线性判别分析、逐步判别分析和得分图进行关联研究，结果表明：血浆中氨基酸代谢谱与血糖值的高低存在相关性，对血糖值6.2的志愿者和血糖值9.5的志愿者，判别分析的总正判率达到了94.1%。逐步判别分析结果表明，有7种氨基酸Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp承载了上述分组的重要信息，其对上述分组的判别分析总正判率为90.2%，可作为反映

3、血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值。 关键词 氨基酸、高效液相色谱、代谢组学、糖尿病1 引言代谢组学作为系统生物学一个新的分支，在疾病诊断 1-2等方面发挥了越来越重要的作用。真正意义上的代谢组学,其目标是样本中所有代谢组分的确切定性及定量, 用所有代谢成分的变化规律来解释整个机体生理状态是最具实际意义的。但严格地讲，目前还没有发展出一种真正代谢组学技术来涵盖所有代谢物而不管分子大小、丰度和性质3-4。但我们可以借鉴代谢轮廓谱分析思路，把“整体”代谢物拆分为几“类”，在“类”即轮廓分析层次上进行样本预处理、分析，在分类研究的基础上可以把得到的数据进

4、行整合，同样可以达到尽可能多的解析代谢物，同时又可以避免用同一种预处理和分析技术对不同类代谢产物产生的不兼容现象。总体来看，与生物有机体代谢活动密切相关的代谢产物主要包括：糖类、脂质类、脂肪酸类、核苷类、蛋白质类、氨基酸类等。许国旺等通过代谢靶标分析，以尿中13-15种核苷类浓度为数据矢量，用主成分分析（PCA）法处理数据，对癌症病人和正常人进行分类研究，识别率达72% 5-6 。梁逸曾等通过对糖尿病患者血浆中脂肪酸轮廓分析，用偏最小二乘-线性判别分析（PLS-LDA）模型进行了糖尿病患者和健康人的模式识别，得到了有价值的生物标记物信息7。目前，对氨基酸类代谢谱的代谢组学研究及其与疾病间的相关

5、分析很少。糖尿病是一典型代谢类疾病，其多种并发症是影响患者生活质量的重要因素，对糖尿病早期及超早期发现与预防尤为重要，用代谢组学方法，寻找糖尿病代谢标记物及早期分类诊断方法，已成为糖尿病研究的重要方向之一8。氨基酸作为代谢网络中重要的一类代谢物，其与糖尿病间一定也存在相关性，本文目的是通过发展氨基酸类代谢谱的代谢组学方法，来寻找其与糖尿病间是否存在联系。本文建立了血浆氨基酸代谢谱柱前在线衍生化HPLC-UV方法，测定了51位志愿者血浆样本，结合多变量统计分析方法，对以血糖值为预分组指标的分类情况进行了关联分析，结果表明，血浆中20种氨基酸代谢谱与血糖值的高低有很强的相关性，其中有7种氨基酸对血

6、糖值高低分组贡献率最大。2实验部分2.1仪器与试剂1200型高效液相色谱系统，配备可变波长紫外检测器（美国Agilent公司）；氨基酸对照品:天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、赖氨酸（Lys）、瓜氨酸（Cit）、鸟氨酸（Orn）、牛磺酸（Tau）及内标物正缬氨酸（Norvaline）、邻苯二甲醛（OPA）、3-巯基乙

7、酸，美国ACCOSTANDARD公司生产；乙腈和甲醇为色谱纯； milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水，美国Millipore公司生产。2.2样品采集与预处理51份血浆样本来自天津中医药大学附属医院，血浆样本采集后，立即冷冻保存于-78冰箱中。样本数B.S6.2为25例，B.S9.5为26例。样本在使用前均在室温解冻，精密量取血浆0.5ml，加入冷HClO4 75L，内标溶液100L，涡旋混合震荡1min，离心（12000rpm 15min），取上清液600L，加入等当量的5mol/L 冷NaOH 189L，二次离心（12000rpm 5min），上清液用0.22m微孔滤膜过滤，滤液用于氨

8、基酸的分析。2.3在线衍生化方法邻苯二甲醛（OPA）为衍生试剂：量取OPA储备液（ 10mg/ml） 1ml, 加入硼酸盐缓冲液（PH10.2）1ml，再加入3-巯基乙醇（3-MPA）100L，混匀后，用0.22m滤膜过滤，待用。衍生化过程在Agilent1200自动进样器上在线自动完成，程序如下：(1)吸取磷酸盐缓冲液(PH10.2) 50L;（2）吸取样品5.0L；(3)吸取OPA 衍生试剂 5.0L;(4)充分混合5次；(5)等待1分钟；（6）进样。2.4色谱条件Hypersil C18反相色谱柱，4.6×250mm，粒径 5m，大连依利特公司生产；流动相A液：10mmol/L

9、 Na2HPO4- Na2B4O7 PH7.95缓冲液，B液为乙腈：甲醇：水 (体积比为45:45:10)，柱温为40，流速为1.5ml/min，进样量5.0L，梯度洗脱：流动相B在30min内由5%-46%；紫外检测波长338nm（谱带宽10nm），参考波长390nm（谱带宽10nm）。3结果与讨论3.1衍生化试剂邻苯二甲醛（OPA），常用、低毒，与伯氨基反应，在室温下只需30s即完成反应，适合在线衍生、提高自动化程度及得到高的重复性。但OPA性质不稳定，极易氧化降解而失效 ，经实验验证，每3天需更换一次，为保证高重复性，本实验中采用24小时更换一次，且实验中样品室设为5以降低其氧化速率。另

10、外，因OPA只能与伯氨基反应，本实验中氨基酸谱只测定了血浆中丰度较高的伯氨基游离氨基酸，对于仲氨基酸（脯氨酸、羟脯胺酸）及丰度较低的氨基酸在今后研究中会继续研究以丰富氨基酸谱信息。3.2血浆氨基酸高效液相色谱分析Pietrzik等认为高半胱氨酸是心血管疾病的标记物，而且还是这种疾病的诱因 9 ，Bonna等不仅认为高半胱氨酸是心血管疾病的风险因子，而且还证明叶酸、VB12不能降低心梗后心血管疾病再发生10。血浆中单个氨基酸与疾病发生密切相关，对氨基酸代谢全谱分析也将成为代谢组学中重要的一部分。氨基酸分子量小，具有两性，有几对氨基酸（Asp/Glu, His/Gly, Arg/Ala, Val/

11、Met）结构性质相近，不宜分离，我们采用经典的邻苯二甲醛为衍生试剂，正缬氨酸为内标物，用柱前衍生化方法建立了血浆中氨基酸代谢谱分析11，图1为血浆样品HPLC-UV色谱图，从图中可见在27min内21种氨基酸（包括Gln）得到了很好的基线分离，其中难分离氨基酸对也得到了很好的分离，分离度均在1以上。经优化后最终采用的方法具有仪器普适性强，分析时间短，样品用量少等特点。182112345678910011121314151617192022e图1 糖尿病血浆样本中游离氨基酸的高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of 21amino acids from plasma

12、of diabetes volunteers1. Asp；2.Glu；3.Asn；4.Ser；5.Gln；6.His；7. Gly；8. Thr；9. Cit；10.Arg；11. Ala；12. Tau ；13. Tyr；14. Val；15. Met；16. Norvaline (internal standard)；17. Trp；18. Phe；19. Ile；20. Orn；21. Leu；22. Lys3.3方法学考察对21种氨基酸组成的标准溶液,连续进样5针,峰面积的相对标准偏差RSD为0.54%3.97%。平行处理5等份同一血浆样本，峰面积的RSD在0.4%4.3%之间。在加标

13、回收实验中 标准品加入量约为样品氨基酸含量的0.8倍（记为R1）和2倍（记为R2），平均回收率在72.1%116.0%之间。由于我们所测定的目标小分子为内源性物质，在回收率实验中不能按照传统考察外源性物质的方法考察高、中、低不同浓度水平的加标回收率。在1.650g/ml浓度范围内（进样体积为5.0L），21种氨基酸的峰面积和浓度之间的线性相关系数r在 0.99440.9999之间。按10倍信噪比计算，21种氨基酸的定量检出限在660ng之间。谷氨酰胺(Gln)由于在水溶液中不稳定,得到的精密度和重复性都不理想,同时,在用高氯酸进行样品前处理时,可能影响了Gln原形的存在，使回收率不高，在后续数

14、据处理时,不予考虑。表1 仪器精密度、方法重复性、回收率及相关系数Table1 Precision、reproducibility、recovery and correlationcoefficient with on-line pre-column derivation HPLC method氨基酸 Amino acid精密度n=5 Precision RSD%重复性n=5 Reproducibility RSD%回收率R1%回收率R2%相关系数r CorrelationcoefficientAsp1.504.33112.0108.20.9944Glu0.540.8897.895.20.99

15、70Asn3.954.3289.690.10.9993Ser0.740.69102.899.30.9997Gln3.9742.0068.067.30.9994His2.931.2077.579.50.9995Gly0.780.6190.492.30.9999Thr0.651.97116.0110.30.9983Cit0.781.7795.096.20.9993Arg1.032.5693.892.60.9998Ala1.490.45105.0104.90.9996Tau0.320.6792.194.80.9993Tyr0.850.83115.0109.30.9986Val0.590.4197.7

16、97.90.9997Met1.942.1190.795.30.9999Trp1.283.6896.597.40.9999Phe0.941.1272.179.30.9997Ile1.112.6086.290.20.9998Orn3.832.6797.690.60.9998Leu3.432.1892.596.30.9999Lys1.692.4184.689.70.99933.4血浆氨基酸代谢谱分析与数据处理<6.2组和B.S.>9.5组。样本经前处理、衍生化和色谱方法测定，得到氨基酸谱中各氨基酸的相对峰面积（分析物与内标物峰面积之比）；在数据处理过程中，综合考察了代谢组学中常用的数据处

17、理模式12-15 ,利用SPSS 16.0软件平台，通过调用discriminant模块中线性判别分析（linear discriminant analysis）函数对氨基酸相对峰面积进行分析处理，得到分组的正判率和判别函数得分（discriminant scores）。20种氨基酸通过逐步判别分析(stepwise discriminant analysis)方法,参考Methods of Multivariate Analysis（ALVIN C. RENCHER）， 利用MATLAB中逐步判别分析函数模块, 提取得到7种aa对分组最有意义。再利用MATLAB 2007a软件平台中的gsc

18、atter函数, 借鉴参考文献16中的数据处理方式，用TP-DA方法，对以20种和7种氨基酸为变量的原始数据做scores plot，得到更加直观的判别结果,如图2。结果显示，用20种氨基酸谱作为分析变量进行线性判别分析，对B.S.<6.2预分组的正判率（hit ratio）达到92.0%，B.S.>9.5预分组的正判率达到96.2%,总正判率达到94.1%，由此可见，用氨基酸代谢谱对血糖值高低分组进行模式识别有重要意义。通过逐步判别分析模式对原始数据进行处理，发现：20种氨基酸代谢谱中有7种氨基酸：Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp承载分组的信息量较大，用这7

19、种氨基酸作为变量进行线性判别分析，结果与全体氨基酸的判别结果相近，总正判率达90.2%(见图2)，二者没有显著性差别,说明两组血浆氨基酸代谢谱的差异，主要来自7种氨基酸，它们可以同时作为反映血糖值高低变化的标志物组。另外，如图2 scores plot显示，B.S.<6.2组和B.S.>9.5组能够很好的分开，但组内样本之间聚类不集中，可能与样本选取有关，在今后工作中还要进一步统一样本标准。AB图2 20种氨基酸（A）和7种氨基酸（B）判别分析得分图Fig 2 TP-discrimination analysis (DA) Score plot using 20 amino aci

20、ds （A）and 7 amino acids (B) as variablesA判别结果：B.S6.2预分组,正判率92.0%； B.S9.5预分组,正判率96.2%；总正判率为94.1%。B判别结果：B.S6.2预分组,正判率88.0%； B.S9.5预分组,正判率92.3%；总正判率为90.2%。其中带标号的样本点为错判的样本号。A classification results: B.S6.2pre-group， hit ratio 92.0%； B.S9.5 pre-group， hit ratio 96.2%；total hit ratio 94.1%. B classificati

21、on results: B.S6.2pre-group， hit ratio 88.0%； B.S9.5 pre-group， hit ratio 92.3%; total hit ratio 90.2%. In graph the point with a label refers to the number of sample discriminated wrongly.通过以上研究，我们认为，氨基酸代谢谱与糖尿病血糖高低之间存在相关性，并且有7种氨基酸（Arg、Cit、Asp、Asn、Thr Leu、Trp）与血糖值高低密切相关，结合生物化学代谢网络，7种氨基酸中有4种（Arg、Asp、

22、Asn、Thr）属于生糖氨基酸（glucogenic amino acid）, Cit属于活跃代谢中间产物，阐明这些氨基酸代谢异常与血糖升高间的关系，能为糖尿病进一步研究提供更多信息。 references1 Brindle JT, Antti H, Holmes E. Nat Med, 2002, 8(12): 143914442 Brain,JR; Stevens,RD; Wenner,BR.Diabetes,2009,58(11):242924433 Xu Guo-Wang（许国旺），Lu Xin（路鑫），Yang Sheng-Li（杨胜利）. Acta Acad Med Sin(中国医

23、学科学院学报), 2007, 29(6): 7017114 Xu Guo-Wang（许国旺），Yang-Jun（杨军）.Chinese J. of Chromatography（色谱），2003，21（4）：3163205 Yang J, Xu GW, Kong HW, Zheng YF, Pang T, Yang Q. J. Chromatography B, 2002, 782：27336 Zheng YF, Xu GW, Liu DY, Xiong JH, Zhang PD, Zhang C, Yang Q. Electrophoresis, 2002,23:410441097 Lun-

24、Zhao Yi, Jun He, Yi-Zeng Liang, Da-Lin Yuan, Foo-Tim Chau. FEBS Letters, 2006,580:683768458 Xu Guo-Wang(许国旺).Metabolomics(代谢组学)Beijing(北京):Science Press（科学出版社），2008：2813119 K.Pietrzik. Clinical Research in Cardioligy, 2006,95:283310 Bonna,KH;Njolstad,I;Veland,PM. New England Journal of Medicine,2006

25、,354:15781588 11 M.Hariharan, Sundar Naga, Ted VanNoord. Journal of Chromatography, 1993,621:152212 Li Jing(李晶), Wu Xiao-Jian(吴晓健)， Liu Chang-Xiao（刘昌孝），Yuan Ying-Jin（元英进）. Acta Pharmaceutica Sinica(药学学报), 2006, 41(1): 475313 Beckwith-Hall BM, Brindle JT, Barton RH. Analyst, 2002, 127(10): 1283128814

26、 Gavaghan CL, Wilson D, Nicholson JK. FEBS Lett, 2002,530(2): 19119615 Holmes E, Antti H. Analyst, 2002,127(12): 1549155716 Dalin Yuan, Yizeng Liang, Lunzhao Yi, Qingsong Xu. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,2008,93:70-79 Classification of diabetes volunteers based on plasma amino aci

27、ds metabolic profilingHan Xiao-Feia Huang Yu-Hongb Wang Long-Xinga Yang Qian-Xua Xiao Hong-Bina* Zhang De-Qinb*（aDalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences，Dalian，116023;bTianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193）Abstract To study on the relation of pl

28、asma amino acids metabolic profiling and diabetes blood sugar level by using metabolomics. A on-line pre-column o-phthalic dicarboxaldehyde（OPA） derivatization HPLC method for relative quantitative determination of 21 amino acids in plasma samples was developed. The derivatization procedure was acco

29、mplished by an online auto-injector and the signals were detected with a UV detector. Mobile phase A was 10mmol/L PH7.95 Na2HPO4- Na2B4O7 buffer, and B was acetonitrile-methanol-water (45:45:10 by volume). The elution program was 5%B at the start and 46% B at the end in 30 min. The 21 amino acids we

30、re separated satisfactorily in 27min. Fifty-one plasma samples from diabetes volunteers were analyzed and were pre-divided into blood sugar ( B.S.) 6.2 group and B.S9.5 group .By SPSS and Matlab software platform, relation analysis was performed by using linear discriminant analysis, stepwise discri

31、minant analysis and scores plot models. By correlating the levels of blood sugar (B.S.) to 20 amino acids peak areas except glutamine, the results showed that the B.S. 6.2 group was discriminated from the B.S9.5 group with a total hit ratio of 94.1%, stepwise discriminant analysis (SDA) model indica

32、ted that 7 out of 20 amino acids，i.e., Arg、Cit、Leu、Asp、Asn、Thr、Trp essentially contributed to the above two groups division with the total hit ratio of 90.2%, which maybe have more means as potential marker groups for the early diagnosis of diabetes and in-depth research.Keywords: Amino acids, HPLC,

33、 metabolic profiling, diabetes英文内容及中文对照 Classification of diabetes volunteers based on plasma amino acids metabolic profilingHan Xiao-Feia Huang Yu-Hongb Wang Long-Xinga Yang Qian-Xua Xiao Hong-Bina* Zhang De-Qinb*（aDalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences，Dalian，116023;bTia

34、njin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193）Abstract To study on the relation of plasma amino acids metabolic profiling and diabetes blood sugar level by using metabolomics. A on-line pre-column o-phthalic dicarboxaldehyde（OPA） derivatization HPLC method for relative quantitative

35、 determination of 21 amino acids in plasma samples was developed. The derivatization procedure was accomplished by an online auto-injector and the signals were detected with a UV detector. Mobile phase A was 10mmol/L PH7.95 Na2HPO4- Na2B4O7 buffer, and B was acetonitrile-methanol-water (45:45:10 by

36、volume). The elution program was 5%B at the start and 46% B at the end in 30 min. The 21 amino acids were separated satisfactorily in 27min. Fifty-one plasma samples from diabetes volunteers were analyzed and were pre-divided into blood sugar ( B.S.) 6.2 group and B.S9.5 group .By SPSS and Matlab software platform, relation analysis was performed by using linear discriminant analysis, stepwise discriminant analysis and scores plot models. By co