荷叶中生物碱的提取及组成成分的分析-

1、 their compositionSHAN Bin 1,2,DENG Ze-yuan 1*,XIONG Dong-mei 1,TANG Li-jun 1,DENG Sheng-guo 1(1.The State Key Laboratory of Food Science &Technology in Nanchang University ,InstituteShaoguan College,Shaoguan 512005Abstract:The second step to extracting alkaloids of a synchronous extracting technolo

2、gy of flavonoids,alkaloids and polysaccharides from lotus leaves was investigated.The optimal process conditions are obtained by orthogonal analysis as follows:pH at 2.0,ethanol concentrations at 90%,ratio of liquid to solid 251,extracting time at 2h and temperature at 80,two successive extractions.

3、After removed ethanol,the solids was dissolved by 0.25%hydrochloric acid,After decolorizated under acidic conditions,the solution was transferred into alkaline,then alkaloids were eluted from the aqueous layer by using D101macroporous resin.The extraction rate of alkaloid is 90.57%,its purity 82.8%.

4、There are five major kinds of flavonoids in Lotus leave:anonaine,pronuciferine,N-Nornuciferine,nunciferine and nornuciferine.Key words:lotus leaves;alkaloids;extraction荷叶是睡莲科中国莲(Nelumbo Nucifera的叶片,被列在食药两用植物的名单之中1。荷叶功能性成分中,黄酮具有抗氧化、清热、降血脂、降胆固醇及治疗心脑血管疾病等功能2-3;荷叶中所含生物碱多为异喹啉类生物碱,主要成分为荷叶碱(Nunciferine、亚美罂

5、粟碱(Armepavine、原荷叶碱(Pronuciferine、收稿日期:2008-03-29*通讯作者基金项目:江西省教育厅2003年重点项目(20030058;教育部创新团队项目(IRT0540。作者简介:单斌(1976,男,硕士研究生,研究方向为功能与保健食品。荷叶中生物碱的提取及组成成分的分析单斌1,2,邓泽元1*,熊冬梅1,唐丽君1,邓胜国1(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学高等研究院,南昌330047;2.韶关学院英东生物科学学院,韶关512005摘要:实验是同步提取荷叶黄酮、生物碱、多糖工艺研究中提取生物碱的工艺部分,在提取荷叶黄酮后的荷叶残渣中提取总生物碱的

6、条件是pH2.0,乙醇浓度为90%,液固比为251,提取时间为2h ,提取温度为80,提取2次。回流除去乙醇后用0.25%盐酸复溶,在酸性条件下脱色后再将溶液调成碱性,经D101大孔树脂洗脱分离得到总生物碱。总生物碱的提取率为90.57%,纯度为82.8%,荷叶中主要的生物碱有5种,它们是番荔枝碱、原荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱和亚美罂粟碱。关键词:荷叶;生物碱;提取中图分类号:TS 201.2文献标志码:A文章编号:1005-9989(200810-0163-04163 N-去甲基荷叶碱(N-Nornuciferine、番荔枝碱(ano-naine等4-7。生物总碱能使肥胖高脂血症大鼠的

7、TC 、TG 及AI 指标下降8,对细菌、酵母菌和霉菌都有较强的抑制作用9,其中苄基喹啉类生物碱具有抗HIV 活性10,可进一步发展成为抗艾滋病病毒的前导物11,荷叶碱在体外具有显著的抗脊髓灰质炎病毒的活力12。本实验通过研究同步分离提取荷叶黄酮、生物碱和多糖3种功能性成分的工艺条件,在提取黄酮后的荷叶残渣中提取纯化生物总碱,为合理开发、综合利用荷叶资源提供了切实可行的工艺路线。1材料与方法1.1实验材料及试剂荷叶:江西广昌产,经测定含黄酮为32.1mg/g粉干粉,含总生物碱4.71mg/g 粉干粉;荷叶碱标准品:色谱纯;D101大孔吸附树脂:南开大学化工厂;盐酸、乙醇、正己烷:分析纯。1.2

8、主要仪器及设备手提式高速中药粉碎机:温岭市大德中药机械有限公司;旋转蒸发仪、HH-S 型恒温水浴锅:巩义市英峪予华仪器厂;HL-2型恒流泵、BSZ-自动部分收集器:上海青浦沪西仪器厂;SP-1910UVPC 双光束紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;高效液相色谱仪;回流提取装置等。1.3实验方法荷叶生物碱的提取将提取黄酮后的荷叶残渣2.3.1所得的水溶液用D101大孔吸附树脂色谱柱进行分离纯化。该分离柱高25cm ,柱径1.6cm ,上样量约为150mL(3BV;用甲醇水溶液浓度10%、20%、30%各200mL(4BV依次梯度洗脱,最后用60%甲醇200mL(4BV洗脱。收集60%甲醇

9、洗脱液部分,用旋转蒸发仪蒸干,即为总生物碱粗品,称量(w 1、备用。(1溴甲酚绿缓冲液的制备:精确称取溴甲酚绿125mg ,用0.2mol/L NaOH 12.5mL 溶解,加入邻苯二甲酸氢钾2.55mg ,加少量水溶解,转移至250mL 容量瓶中定容,备用。(2荷叶碱标准曲线的制作:精确称取荷叶碱4mg ,置于100mL 容量瓶中,加无水乙醇定容。分别取40g/mL 荷叶碱溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL 于50mL 容量瓶中,加氯仿至刻度,振摇,移至分液漏斗中,精确加入溴甲酚绿缓冲液和0.2moL/L NaOH 各10mL ,摇匀,静置,取澄清的氯仿液在415

10、nm 波长处进行测定。由测定结果计算出回归方程为:C(g/mL=59.01A-9.565,相关系数R =0.9999(式中c 为生物碱浓度,mg/mL ;A 为吸光度。(3荷叶总生物碱含量的测定:准确称取一定量的生物碱粗品(w 2,单位为mg,按上述方法同样处理后进行测定,根据回归方程计算出荷叶总生物碱的浓度并换算成荷叶总生物碱的含量(w 3,单位为mg。荷叶总生物碱提取物纯度的计算公式:n(%=w 3/w 2100;提取量的计算公式:m(mg=w 1n 1000;提取率e(%=m w 4.71100,(n 为测定前的稀释倍数;w 为提取前所用荷叶干粉量,g。将一定量的生物碱提取物,用甲醇溶解

11、,采用HPLC-MS 法检测生物碱组成及分子量,色谱条件为:C 18反相柱,柱温20,流速0.7mL/min ,检测波长272nm ,参照波长360nm ,流动相A 为0.05%的三乙胺水溶液;流动相B 为乙腈,进行梯度洗脱:016min ,B%为3235;1619min ,B%为3565;1930min ,B%为6575。2结果与分析2.1荷叶总生物碱提取正交实验结果实验在提取黄酮之后的荷叶干粉残渣中提取生物碱,根据单因素试验结果及对同步分离提取黄酮,生物碱及多糖的工艺要求,以生物碱提取率的最大化为目标,首先确定了提取条件是提取次数为2次,提取温度为80。采用L 9(34正交表,对影响生物碱

12、提取率的主要因素pH 值(A=2.0、3.0、4.0,乙醇浓度(B=70%、80%、90%,提取时间(C=1.5、2.0、2.5h,提取液用量(液固比D=201,251,301进行了优化。正交实验方案及结果见表1。由表1正交实验结果进行极差分析可知,R A(8.70R B (7.61R D (5.95R C (2.71,即4因素对生物碱提取率的影响程度大小顺序为:pH 值(A乙醇浓度(B提取液用量(D提取时间(C。K 1(A、K 3(B、K 3(C、K 3(D分别为相同因素各水平中的最大实验值,则最优工艺条件为A 1B 3C 3D 3。由于从正交实验表极差分析可知K 2(C=80.6380.6

13、6=K 3(C,即提取时间2h 与2.5h 对实验的影响差别很小,同样,K 2(D=81.60和K 3(D=81.66两者也相差很小,从经济的角度考虑,选取提取时间2h ,液固比251为提取的最优条件,即A 1B 3C 2D 2。综上所述,提取生物碱的最优工艺条件为pH2.0,乙醇浓度为90%,液固比为251,提取时间164 m A U200225250275300325350375E250200150100500波长/nmD200225250275300325350375300250200150100500m A U波长/nm200225250275300325350375200C波长/nm

14、m A U波长/nmB200225250275300325350375140120m A UABCDE10152025实验号因素生物碱提取率/%pH 值A 乙醇浓度/%B 提取时间/h C 提取液用量D8.707.612.715.95表1提取荷叶生物碱正交实验结果(温度80,提取2次为2h ,提取温度为80,提取2次。经用此最优工艺条件对5g 荷叶干粉提取,并进行黄酮和生物碱提取量的测定,结果为:总生物碱粗品为25.79mg ,提取量为21.35mg ,提取率为90.57%,纯度为82.8%。经三氯化铝显色法测定14,粗品中含黄酮3.10mg 。经蒽酮-硫酸法检测15,粗品中不含多糖。2.2H

15、PLC-MS 法测定荷叶总生物碱的组成HPLC 法测得荷叶总生物碱组成的图谱见图1。经标准加入法测定,D 为荷叶碱(Nunciferine 。图1中AE 各物质的紫外扫描特征吸收谱图见图2,发现AE 各物质对应的紫外吸收峰符合异喹啉类生物碱的紫外吸收特征。AE 各物质的质谱图见图3,其分子量分别为M A 265,M B 311,M C 281,M D 295,M E 311,因此推测A 可能为番荔枝碱(Anonaine,B 为原荷叶碱(Pronuciferine,C 为N-去图1HPLC 测定粗品中生物碱的组成200225250275300325350375nm6040200Am A U波长/

16、nm165 3003004300300300334.3265.1323.1265.1315.1331.4268.9282.1312.2A B CD E 甲基荷叶碱(N-Nor-nuciferine,E为亚美罂粟碱(Armepavine。图3AE各物质的LC-MS质谱图3讨论目前,从荷叶中提取生物碱的工艺主要有两类,一类是较高浓度的乙醇水溶液提取生物碱后经大孔树脂纯化16-17,这类工艺能将荷叶多糖有效保留在提取后的荷叶残渣中,但同时也提取了大部分黄酮成分,且采用大孔树脂纯化时,荷叶黄酮与生物碱的洗脱具有同步性,所以难以将两者有效分离。另一类是用盐酸水溶液提取生物碱,经脱色,除鞣质后,在强碱性条

17、件下用氯仿反复萃取生物碱18-19,这类工艺能同时将多糖,生物碱及大部分黄酮提取出来,但黄酮成分的提取不完全,脱色过程也会造成黄酮的损失,且用NaOH溶液调强碱性时会造成黄酮的氧化,对萃取后的水相中苘叶多糖的纯化也较为困难,损失也较大。本工艺在提取荷叶生物碱的同时,能依次将荷叶黄酮和荷叶多糖提取分离,且三者的纯化工艺简单,能获得较高的得率和纯度。参考文献:1姜兴俊.荷叶(含荷蒂、荷梗古今应用概说J.中国中药杂志,1997,6(22:374-3782陈灏珠,金雪娟.我国人群血脂水平现状和对策J.中国工程科学,2002,4(11:1-63龚康敏,历兰娜,姚雪梅,等.荷叶合剂对小鼠及高脂血症大鼠血脂

18、代谢的研究J.中国中医药科技,1998,5(5:294-2954国友顺一.莲的研究:古莲的生物碱J.药学杂志(日,1964,84(11:1141-11425刘密新,吴筑平,等.荷叶精油与生物碱的分析研究J.清华大学学报,1997,37(6:35-376Kunitomo J.Alkaloids of Nelumbo nuciferaJ.Phytochem-istry,1973,12:699-7017Yang T H,Chen C.Alkaloids of the lotus receptacleJ.ChinChem Soc(Taipei,1972,19:1438涂长春,李晓宇,杨军平,等.荷叶生物总碱对肥胖高脂血症大鼠减肥作用的实验研究J.江西中医学院学报, 2001,13(3:120-1219唐裕芳,张妙玲,刘忠义,等.荷叶生物碱的提取及其抑菌活性研究J.广州食品工业科技,2004,20(2:51-53 10柏田良树.抗HIV天然物的研究J.荷叶的抗HIV成分.国外医学中医中药分册,1997,19(6:4511Kashiwada Y,Aoshima A,Ikeshiro Y,et al.Anti-HIVbenzyliso-quinoline