小颗粒脂肪移植碱性成纤维细胞生长因子及缓释剂浓度的正交筛选

1、    小颗粒脂肪移植碱性成纤维细胞生长因子 及缓释剂浓度的正交筛选        【摘要】目的解决游离脂肪移植吸收问题。方法根据碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的生物学特性，以纤维蛋白作为缓释剂，参与小颗粒状脂肪移植。并采用正交法设计，观察bFGF及缓释剂浓度与效应关系。结果术后3个月，移植物重量变化在差位级为98%，好位级为225%。后者基本与动物体重同步增长。脂肪生存及增殖与bFGF缓释剂浓度关系密切。在0.2g移植脂肪中加入bFGF1 000U、2 000

2、U或4000U，以4000U效果最佳。缓释剂浓度1 000mg/L，2 000mg/L，或3 000mg/L，以1 000mg/L为佳。组织学观察各移植物均有被膜、纤维间隔。脂肪组织结构良好，细胞成熟。结论bFGF在以纤维蛋白为缓释剂条件下，对移植脂肪具有良好的促增殖作用。其效应具有浓度依赖关系。【关键词】脂肪移植碱性成纤维细胞生长因子游离脂肪移植在百余年应用历史中一直受过度吸收的困扰。80年代以来，小颗粒脂肪移植虽给脂肪移植带来新的希望，但吸收问题依然存在1。1992年我们开始应用bFGF于脂肪移植。其早期血管形成效应已得到证实2。我们初步报道bFGF参与下移植脂肪的生存、增殖作用。1材料与

3、方法1.1纤维蛋白原提取。人血浆以12.5%NaSO4沉淀纤维蛋白原，溶解，上葡聚糖柱层析后收集，电泳定性，透析，真空干燥后备用。1.2bFGF(珠海东大生物公司提供)与白蛋白结合。4万个单位加入1mg/ml人白蛋白0.2ml，真空干燥备用。1.3动物处理及结果观察。SD大鼠9只，体重190240g。雄性。3%戊巴比妥钠(0.1ml/100g)腹腔麻醉。取腹股沟区脂肪0.2g，剪成20小块，使用1ml注射器接16号针头能顺利通过。双侧下颌角下方各做一5mm切口，分离咬肌与皮肤(此区域无皮下脂肪)。双侧各植入0.2g脂肪。植入前按正交设计加入不同浓度bFGF10l，纤维蛋白原10l(表1)，并以

4、100g/ml凝血酶10l促凝。植入后，伤口缝一针。动物术后3个月处死。沿被膜取出移植物称重。标本用10%福尔马林固定。缓慢脱水、制片、HE染色观察组织变化。2结果取材可见移植组织与深面咬肌、浅面皮下均有明显界限，被膜表面肉眼见血管丰富、组织丰满(1，2)。组织重量变化及动物体重变化见表1。正交表计算结果见表2。 表1bFGF、纤维蛋白原浓度及动物、移植物重量Tab 1 Weight of graft,concentration of bFGF and fibrinogen in each animalbFGF纤维蛋白原动物体重移植体重量(g)序号(1000U/10l)(1000mg%)(g)

5、(术后3个月)左右左右术前术后3个月左右142332004600.3630.163221332004350.2570.175314322404550.1980.360442222204500.3050.235521222304700.2980.249614212104300.3090.371742111904200.5320.506821112404400.2740.218914132304300.2050.402组织学结果所有标本均存在被膜、纤维间隔。脂肪组织结构完好；细胞分化成熟(3，4)。某些区域有灶性或散在淋巴细胞浸润。其中纤维蛋白浓度较高的移植物其纤维被膜及间隔较厚；低浓度者较菲薄。

6、低浓度bFGF参与的移植物标本存在个别小坏死灶并为囊样脂池。3 讨论脂肪移植作为颜面部软组织凹陷的皮下充填物应是理想材料。过度吸收是脂肪移植的难题。虽然近年来广泛采用的小颗粒脂肪移植已 表2正交试验结果计算Tab 2 The result from data of experiment by othogonal design位级bFGF(1000U/10l)纤维蛋白原(1000mg%)143222311各位级组织左右左右组织重量总和重量和(g)(g)左右(位级1)1.2001.1330.8180.760(位级2)0.8290.9080.9120.8482.7412.703(位级3)0.7120

7、.6621.0111.095极差、中最大最小0.4880.4710.194较传统的整块脂肪移植吸收有所减少。术后12周前颗粒移植为原重量27.1%，块状移植为17.3%。24周后两者均进一步吸收3。本实验最佳级别移植组织重量变化为223%；动物体重变化为215%，几乎与动物体重同步增生。差级别组织重量变化为98.25%，显示bFGF促进移植物生存和增长的巨大作用。bFGF的促血管生成作用，在早期提供移植物以充分血供。从而保证移植物的生存条件。细胞培养显示bFGF对血管内皮细胞有明显的促分裂和增殖作用4。Kouri等在皮瓣移植中观察到bFGF促进皮瓣与受植床血管接通再生5。笔者1994年报道小颗

8、粒脂肪移植中，bFGF诱导血管早期形成作用。术后5，7，10天，经灌墨计数，移植物血管均显著高于对照侧2。单纯血管生成提供移植物充分营养，似乎不足以获得令移植物伴随动物体重增长而增长的结果。bFGF对脂肪细胞及脂肪前体影响的研究目前甚少，然而，bFGF作为一组多功能生长因子，对中胚叶，外胚叶细胞也都具有促进分化、分裂、增殖功能，正受广泛关注。成肌细胞经过bFGF培养2天，注入活体，28天后检测到-单乳糖量酶阳性纤维化较对照侧高4倍6。可见bFGF对促进间叶源细胞的分化成熟有明显效应。而bFGF是否能促进脂肪细胞前体分化成熟有待证实。从本实验结果推测，似乎有些可能性。对于成熟细胞软骨细胞有刺激增

9、殖作用7。脂肪细胞虽属终末细胞，在bFGF等成份作为促脂肪细胞生长因子参与的细胞培养中，可见增殖8。正交法是一种高效的实验设计。实验9只动物18侧移植，二因素三水平各可获得6次参与。双侧交叉重复。术后3个月，移植物总重量基本一致，各级别顺序不变。重复性好，可排除系统误差。从正交法计算结果可见bFGF对移植脂肪的增殖具有剂量依赖性。0.2g移植脂肪加入bFGF1 000U、2 000U、4 000U。其增殖程度递增。而作为缓释剂的纤维蛋白原浓度不宜过高。结果显示浓度为3 000mg/L,2 000mg/L,1 000mg/L的纤维蛋白原中，低浓度效果较好。组织学观察高浓度纤维蛋白原参与的组织标本

10、纤维被膜及间隔较厚。这可能因高浓度纤维蛋白原形成更致密而厚的纤维蛋白网而影响bFGF的释放而妨碍发挥作用。我们仅从组织移植中观察到bFGF在缓释条件下促使移植脂肪重量增殖效应。其机理有待进一步探讨。1，2 术后3个月，移植脂肪被膜完整血管丰富组织丰满，1为移植物深面，2为浅面3，4 术后3个月移植脂肪被膜包裹，纤维组织分隔，脂肪细胞成熟Fig1,2 Postoperative 3 months, the transplanted fat tissue showing fullness and with a capsule exhibiting prominent blood vessel ne

11、tworks, fig 1 showing deep surface of gratf and fig 2 showing superficial surfaceFig3,4 Postoperative 3 months, sevtions of graft showing normal adipocyte morphology surrouded and separated by fibrotic tissue本课题受海南省自然科学基金资助作者单位：570311海南省人民医院口腔科(廖天安、陈丽媚)；海南医学院病理教研室(谢富生)，附属医院口腔科(王琼超、符起亚)参考文献1Eppley BL

12、,Smith PG,Sadove AM.Experimental effect of graft revascularization and consistency on cericofacial fat transplant survival.J Oral Maxillafac Surg,1990,48:54-62.2廖天安，谢富生，符起亚，等.碱性成纤维细胞生长因子在自体脂肪游离移植中血管生成的早期作用.中国修复重建外科杂志，1994，8：239-241.3鲍卫汉，张宋学，孙光晓，等.脂肪小珠皮下注射的实验研究和临床应用.中华整形烧伤外科杂志，1994，10：364-367.4Ingber

13、 DE,Folkmam J.Mechaniochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growrth factor-stimulated angiogenesis in vitro:role of entracellular matrix.J Cell Biol,1989,109:317-330.5 Kouri RK,Brovon DM,Khouri Leal SM et al. The effect of basic fibroblast growth factor on the neovascularisation process:skin flap survival and staged flap transfers.Br J Plast Surg,1991,44:585-588.6 Kinoshita I,Vilquin JI,Tremblay JP.Pretreatment of myoblast cultureswith basic fibroblast growth factorincrease the efficacy of their transplantation in mdx mice.