表面活性剂增敏荧光光度法测定牛奶中的三聚氰胺

1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第2期2010年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry249252DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00249表面活性剂增敏荧光光度法测定牛奶中的三聚氰胺黄晖李丽马乔冯钰锜何治柯3(武汉大学化学与分子科学学院,生物医学分析化学教育部重点实验室,武汉)摘要性剂(CTMAB)对三聚氰胺荧光强度的增敏作用,在pH.2MAB为增敏剂,测定三聚氰胺,线性范围为251000g/L,1.6%。按国标方法处理样品,采用本法测定,回收率偏高;,实际样品检测获得满意结果。此方法简便、快捷。关键词;三聚氰胺;荧

2、光光度法;固相萃取整体柱1引言三聚氰胺(Melamine,M)对人和动物造成的危害已引起广泛关注。2008年10月我国发布的公告规定:婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg;液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三12聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。目前,三聚氰胺的检测方法主要有:液相色谱法(HPLC)、液相色3,456谱2质谱法(HPLC2MS)、气相色谱2质谱法(GC2MS)和毛细管电泳等。针对这些方法,国家质检总局、国家标准化管理委员会批准发布的原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法中,高效液相色谱7法的定量限为2mg/kg,液相色谱2质谱/质谱法的定量限为0.01mg/kg。

3、但上述检测方法均需使用大810型仪器,且操作繁琐。固相萃取整体柱与被分析物之间的选择萃取作用已得到广泛应用。本研究利用三聚氰胺在弱碱性介质中能产生荧光,表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)的增敏作用,22丙烯酰胺222甲基212丙磺酸2乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物(AMPS2co2EDMA)固相萃取整体柱对三聚氰胺良好的富集分离作用,采用整体柱对牛奶样品进行预处理,实现了实际样品的准确检测。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,其分子中含有共轭双键(键)结构,及3个给电子取代基NH2,其激发态由环外氨基上的n电子激发转移到环上而产生。由于它们n电子的电子云几乎与芳环上轨道平行,因而实际

4、上它们共享了共轭电子结构,扩大了其共轭双键体系,故具有荧光特性,在非极性的介质中,它的荧光较弱,随着介质极性的提高,其荧光强度也随之增大,当它处于酸性介质中时,取代基NH2会质子化为NH3,荧光强度明显减弱,甚至无荧光发生;而在弱碱性介+质中,其荧光强度明显增强。据此建立了荧光分光光度法测定牛奶中三聚氰胺的方法。本方法适用于牛奶样品中三聚氰胺的快速初筛及检测。2实验部分2.1仪器与试剂RF25301pc荧光分光光度计(Shimadzu公司),LS55荧光分光光度计(PerkinElmer公司),PB210酸度计(Sartorius公司),TGL216G高速离心机(北京泽祥恒达科技发展公司),K

5、Q2200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),S25涡旋仪(IKA公司),旋转蒸发器RE25299(巩义市英峪高科仪器厂),TS2260双重注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)。三聚氰胺,Tris(Sigma公司),Brij35(Acros公司),十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、十二烷基苯磺酸钠(DDBS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙腈、正己烷,三氯乙酸,HCl和NaOH均为分析纯试剂,Tris2HCl缓冲体系(pH=8.0),水为Milli2Q超纯水。2009206223收稿;2009208228接受本文系国家自然科学基金(Nos.90717111,20621502)资助项目3E2ma

6、il:zhkhe250分析化学第38卷2.2实验方法2.2.1标准溶液的配制三聚氰胺(M)标准工作液的配制:精确称取适量三聚氰胺标准品,配成质量浓度为1.000g/L的储备液。准确移取适量标准储备液,配制浓度为10mg/L三聚氰胺标准工作溶液。2.2.2荧光强度的测定在塑料离心管中依次加入2mLTris2HCl缓冲溶液、1.0mLCTMAB溶液、0.2mL三聚氰胺标准工作溶液,加入超纯水定容至4mL,室温超声10min,放置5min后,测定荧光强度。处理样品。在离心管中分别准确移取1mL牛奶样品,加入5mLHCl酸化乙腈(pH=2.0),超声10min,使蛋白质沉淀,以r/min转移合并上清液

7、,向上清液中多次加入20mL正己烷,振荡,静置,将下层清液2.2.3样品制备方法1按国标法7减压蒸干,水溶,用微孔滤膜过滤得清液备用;方法2品。在离心管中分别准确移取1mL,5(pH=3.0),涡旋1min,超声10min,使蛋白质沉淀,以8000r/m,用0.22m微孔滤膜过滤得待净化液。(本实验室研制)中,用TS2260双重注射泵,以100L/min,再用5%氨化甲醇洗脱,洗脱液于50下氩气吹干,残留物用水定容,1min,过0.22m微孔滤膜后,供测定用。73结果与讨论3.1M2CTMAB体系的荧光光谱比较阳离子表面活性剂CTMAB、阴离子表面活性剂DDBS、SDS、非离子表面活性剂Bri

8、j35等表面活性剂对三聚氰胺荧光强度的增敏作用,发现表面活性剂CTMAB增敏效果较好。按2.2.2实验方法进行实验,得到M2CTMAB体系荧光激发光谱和发射光谱(图1)。由图1可见,在pH=8.0的Tris2HCl缓冲溶液中,M2CTMAB体系有2个激发峰,分别位于234和280nm,最大激发波长为234nm。在此波长激发下,三聚氰胺体系在345nm处有一个荧光峰(曲线3),以表面活性剂CTMAB增敏后,此处的荧光强度明显增强(曲线2)。3.2缓冲体系酸度和缓冲溶液用量对M2CTMAB体系荧光强度的影响图1M2CTMAB体系的激发光谱(1),发射光分别将pH4.58.5的磷酸盐缓冲溶液、pH7

9、.0()MAB增敏时的发射光谱(3)1015的Tris2HCl缓冲溶液、HCl溶液(pH为0,1,2)和谱2和无CTFig.1FluorescentexcitationspectraofmelamineNaOH溶液(pH为12,13,14)2mL加入M2CTMAB体系中,结果发现,在pH<6.5的酸性体系中,M2CTMAB体系melamineinbuffersolutionswithCTMAB(2)and无荧光;在NaOH碱性体系中,荧光强度较弱;在磷酸盐缓withoutCTMAB(3)冲体系中,当pH>7.0时,在345nm处有较强且稳定的荧光峰;Tris2HCl缓冲体系中,当p

10、H>7.5时,在345nm处也有较强且稳定的荧光峰,且荧光强度比磷酸盐缓冲体系强(图2)。同时比较了pH=8.0的硼酸2NaOH、硼砂2HCl、KH2PO42硼砂缓冲溶液体系,其荧光强度均低于Tris2HCl缓冲体系,故实验选择pH=8.0的Tris2HCl缓冲体系。取不同体积的pH=8.0的Tris2HCl缓冲溶液,按2.2.2实验方法进行实验,结果如图3。从图3可知,当缓冲溶液用量大于1.2mL时,荧光强度最大且趋于稳定,实验选择pH=8.0的Tris2HCl缓冲溶液用量为2mL。3.3表面活性剂种类和用量及离子强度对荧光强度的影响考察阳离子表面活性剂CTMAB、阴离子表面活性剂DD

11、BS、SDS、非离子表面活性剂Brij35对三聚氰胺荧光强度的增敏作用。实验发现,阴离子表面活性剂DDBS和SDS不能增强三聚氰胺荧光强度,阳离子表面活性剂CTMAB和非离子表面活性剂Brij35均对三聚氰胺荧光有增敏作用,但CTMAB的增敏作用略强,故选用CTMAB为增敏剂。改变CTMAB用量(0.10,0.25,0.50,0.75,1.0和1.25mL),按2.2.2的实验方法进行实验。当CTMAB用量在0.5mL以上,荧光强度趋于稳定(F190),故实验(M)2CTMAB(1),fluorescentemissionspectraof第2期黄晖等:表面活性剂增敏荧光光度法测定牛奶中的三聚

12、氰胺251图2pH对M2CTMAB体系荧光强度的影响Fig.2EffectofpHonfluorescenceM2CTMAB23quantityofbuffersolutiononfluorescenceofM2CTMAB.0实验发现,在相对误差±5.00%范围内,加入0.5mL2mol/LNaCl3.4M2CTMAB体系的超声时间和体系的稳定时间改变超声时间进行实验。结果发现,在室温条件下,超声时间超过3min,体系的荧光强度已基本稳定。为了使M2CTMAB体系更稳定,选择超声时间为10min;在030min内对已超声10min的M2CT2MAB体系荧光强度进行测定,发现M2CTM

13、AB体系荧光强度稳定。为实现快速测定三聚氰胺,本实验选择超声后放置5min测定。将体系放置2h后测定,体系荧光强度依然稳定。3.5工作曲线和检出限按优化条件测定不同浓度的三聚氰胺标准溶液,结果如图4。标准曲线方程:F=0.2552c(g/L)2+64.754,r=0.9995。式中F为荧光强度,C为溶液浓度,线性范围为251000g/L。对空白溶液进行9次测量,以其标准偏差3倍除以斜率得出该方法的检出限19g/L。对500g/L的三聚氰胺标准溶液9次平行测定值的相对标准偏差为1.6%。图4不同含量M存在下体系的荧光光谱3.6共存物质的干扰Fig.4EmissionspectraofM2CTMA

14、Binbuffersolutions当三聚氰胺溶液浓度为500g/L,相对误差±5.00%范围内,考察发现,牛奶中一些常见物质对2+2+33+2+三聚氰胺测定的最大允许倍数分别是:Ca(300),Mg(300),K(4.16×10),Fe(25),Cu4(40),Zn2+(400),乳糖(1.43×10),维生素C(25)。干扰实验结果表明,上述共存物质允许倍数均大于其在牛奶中的相对值,实际测定中不会对三聚氰胺的测定造成干扰。3.7样品分析withdifferentconcentrationsofM采用两种方法分别对奶样进行前处理,并进行测定,均未检出三聚氰胺。对

15、样品进行各个浓度水平的加标回收率测定,结果如表1所示。对两种样品预处理的方法进行比较,可以看出,方法1中,样品的表1样品加标回收率Table1Recoveriesofspikedsample序号No.123加入量Added(g/L)25125250方法1Method1测量值回收率Found(g/L,n=6)27.6131.8262.4Recovery(%,n=6)110.3105.4105.0RSD(%)3.2.2.823序号No.123加入量Added(g/L)25125250方法2Method2测量值回收率Found(g/L,n=6)23.7121.8250.5Recovery(%,n=6

16、)94.797.4100.2RSD(%)6.4.3.574252分析化学第38卷加标回收率均高于实测值,易导致实际样品测定过程中出现假阳性,造成较大误差;方法2使用固相萃取整体柱进行预处理,样品的平均回收率接近实际加入量,避免假阳性的产生,提高了方法的可行性。本方法样品前处理简单,分析时间短,不需使用大型仪器,且经济环保。可用于大量牛奶样品中三聚氰胺的快速初筛及检测。References1BulletinNo.25ofMinistryofHealthofP.R.China,MinistryofIndustryandInformationofP.R.China,MinistryofAgricul

17、tureofP.R.China,StateAdministrationforI&ministra2tionofQualitySupervision,InspectionandQuarantineofP.BLimitationofMelamineinMilkandtheDairyProducts)卫生部、2008年第25号(关于乳与乳制品)p:2Muiz2os2SG,Rosales2martinezD,Gonzalo2LumbrerasR,Santos2MontesA,Cubedo2Fernandez2TrapiellaA,IRC.Anal.Bioanal.Chem.,2008,392(

18、3):5235313AndersenWC,TurnipseedSB,KarbiwnykCM,ClarkSB,MadsonMR,GiesekerCM,MillerRA,RummeNGL,ReimschuesselR.J.Agric.FoodChem.,2008,56(12):434043474LIAi2Jun(李爱军),ZHANGDai2Hui(张代辉),MAShu2Min(马书民),LIMing(李明),ZHANGXiu2Zhen(张秀珍),YAOTian2Ling(姚天灵).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),2008,36(5):6997015WUHui2Qin(吴惠勤),

19、HUANGFang(黄芳),LINXiao2Shan(林晓珊),DENGXin(邓欣),MAYe2Fen(马叶芬),HUANGXiao2Lan(黄晓兰),ZHUZhi2Xin(朱志鑫),LUOHui2Tai(罗辉泰).ChineseJ.InstrumentalAnalysis(分析测试学报),2008,27(10):104410486RAOQin2Xiong(饶钦雄),TONGJing(童敬),GUOPing(郭平),LIHai2Yan(李海燕),LIXiao2Wei(李晓薇),DINGShuang2Yang(丁双阳).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),2009,37(9):

20、134113447GB/T2238822008.DeteminationofMelamineinRawMilkandDairyProducts(原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法).NationalstandardsofP.R.China(中华人民共和国国家标准)8ZhengMM,ZhangMY,FengYQ.J.Sep.Sci.,2009,32(11):196519749YINHong2Rui(尹宏瑞),MAQiao(马乔),FENGYu2Qi(冯钰锜).J.Anal.Sci.(分析科学学报),2009,25(1):172010HUANGJing2Fang(黄京芳),FENGYu2Qi(冯钰锜

21、),LINXing2Hua(林幸华).Chin.Pharm.J.(中国药学杂志),2009,44(12):941945DeterminationofMelamineinMilkbyFluorescentSpectrophotometrywithCetyltrimethylammoniumBromideHUANGHui,LIli,MAQiao,FENGYu2Qi,HEZhi2Ke3(KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforBiologyandMedicine,MinistryofEducation,CollegeofChemistryandMolecularSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072)AbstractMelamineisakindoftriazinecompoundandthe