荧光原位杂交技术_FISH_及其在植物分子细胞遗传学中的应用与展望

1、甘蔗糖业 2012年第1期，2012年2月Sugarcane and Canesugar No. 1, Feb. 2012荧光原位杂交技术(FISH)及其在植物分子细胞遗传学中的应用与展望林秀琴1，毛 钧1，陆 鑫1，刘新龙1，马 丽1，蔡 青1,2,3(1云南省甘蔗遗传改良重点实验室/云南省农业科学院甘蔗研究所，云南开远661600；2云南省农业科学院生物技术与种质资源保存研究所，云南昆明650223；3云南大学生命科学院，云南昆明650091)摘 要：荧光原位杂交是在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法。该技术在研究植物分子细胞遗传学、基因扩增、基因作图及植物进化和亲缘关系的鉴定上已广泛

2、应用。本文简要介绍了荧光原位杂交探针类型、探针标记方法和染色体制片技术等，概述了荧光原位杂交技术在构建植物基因组物理图谱，功能基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测，减数分裂时期染色体行为研究和探讨种的起源中的应用与展望。关键词：荧光原位杂交技术；外源染色质的检测；染色体行为；种的起源中图分类号：S566.1 文献标识码：A 文章编号：1005-9695(2012)01-0051-07Applications and Prospects of Fluorescence in situ Hybridization on PlantMolecular CytogeneticsLIN Xiu-q

3、in1, MAO Jun1, LU Xin1, LIU Xin-long1, MA Li1, CAI Qing1,2,3(1Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy ofAgricultural Sciences, Kaiyuan 661600; 2 Biotechnology & Genetic Germplasm institute, Yunnan Academy of AgriculturalSciences, Kunmin

4、g 650223; 3School of life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091)Abstract: Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a most effective method of detecting alien chromatin atmolecular level. It plays an increasing important role in a variety of research fields, such as plant molecularcytogenet

5、ics, gene amplification, gene mapping, evolution and identification of the relation ships of differentspecies. In this paper, the probes used in this technique, probes label methods and chromosome preparation wereintroduced. The application of FISH in plant genomic physical atlas estimation, functio

6、nal gene location, fordistant hybrid identification and alien chromatin detection, analysis of chromosome behavior in meiosis,origination of species are summarized and prospected.Keywords: Fluorescence in situ hybridization(FISH); Exoqenous chromatin detection; Chromosomes behaviour;origin of specie

7、s.1 荧光原位杂交技术介绍荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)始于20世纪70年代1，其原理是：DNA或RNA序列首先被报告分子(Reporter molecules)标记，通过原位杂交使荧光分子沉积在特定DNA序列位点的染色质上，在探针杂交位点便可见不连续收稿日期：2011-11-22；修回日期：2012-02-20基金项目：国家人事部留学人员科技活动优秀项目、农业部作物种质资源保种项目（NB2011-2130135-18）。作者简介：林秀琴(1983-)，女，福建华安人，硕士；方向：甘蔗分子细胞遗传学研究；通讯地址：66160

8、0 云南省开远市灵泉东路363号 云南省农业科学院甘蔗研究所；TelE-mail：linxiuqin07。通讯作者：蔡青，E-mail：caiqingysri。-52-甘蔗糖业 2012年第1期 Sugarcane and Canesugar的荧光信号。该技术的应用扩展了生物学研究的领域。荧光原位杂交广泛被运用，主要是由于以下几方面的原因：FISH的灵敏度接近同位素标记探针杂交2-3，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；DNA序列能被定位在目标范围从载

9、玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中4；探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；荧光显微镜和数字成像系统在过去20多年中不断改进；特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多种探针混合运用情况下出现特异信号；未标记的基因组DNA 通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。随着FISH技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制(CISS)技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA合成(PRINS)技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH以及近年来微阵列技术(M

10、icroarray)等。同时，原位杂交靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，提高了FISH技术的分辨率，即2个不同DNA探针能够被检测到的最小距离，由1 Mb发展到1 kb，这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。本文主要介绍了荧光原位杂交探针类型、探针标记方法的发展、染色体制片技术的发展等，综述了荧光原位杂交技术在植物分子细胞遗传学方面的应用与展望。2 原位杂交探针类型2.1 染色体特异性重复DNA序列在特异染色体类型上重复元件可达106拷贝数，现已有大量的重复序列，主要包括rDNA基因、端粒重复序列、着丝粒重复序列等被克隆5，这些序列定位于染色体的着丝粒或端

11、粒，当标记和杂交具有足够严谨性时，这些探针在着丝点附近或特异染色体类型的异染色质区和间期染色质的浓缩区域产生强烈和浓缩的杂交区域。主要用于快速检测染色体单体、三倍体、染色体基数及倍性研究6。2.2 染色体文库探针从基因组DNA文库中分离出来的全长染色体探针，用于鉴定染色体的异位或畸变。2.3 基因组探针利用某一物种的基因组DNA作为探针，与另一物种的染色体进行原位杂交，可用于分析异源多倍体基因组组成、起源、演化以及基因组间的亲缘关系。在高等植物基因组中序列重复很常见，编码序列在染色体总DNA 中的比例只有不足0.5%，中度和高度重复序列构成了植物基因组的绝大部分DNA序列。但是并非所有的重复序

12、列都具有物种特异性，表明其具有很低的进化保守性。由于它们在探针和目标DNA 中具有较高频率，重复序列退化比高度保守的单一序列更快。因此，当总DNA作探针时，应依据各染色体组DNA同源性程度的差异进行种属特异性标记。2.4 单拷贝或低拷贝基因单拷贝或低拷贝基因作为探针的应用发展缓慢，原因在于植物细胞壁阻碍探针与靶序列的结合，并且多数低拷贝序列是几个kb小片段，探针与靶序列相遇的几率很小，杂交位点检测率随探针大小的降低而降低。然而，尽管较低的杂交效率(20%50%)，该方法在植物上已起步，如检测豌豆中的豆球蛋白基因的DNA序列，用生物素标记的探针检测豌豆中的低拷贝序列(13.5 kbp)等7。近几

13、年，使用BAC-FISH技术使上述2个问题得到了一定程度的解决，大大提高了信号的检出率8。它主要用于功能基因的定位和检测靶细胞特定的拷贝数和结构变化。3 探针标记方法的发展3.1 放射性原位杂交(Isotopic ISH)最初，人们普遍采用将含有放射性同位素的核苷酸掺入探针中，杂交后，再通过放射自显影技术显示杂交位置的原位杂交技术分析原核生物的DNA序列组织。这种标记方法的特点是灵敏度高，杂交信号强，但它不安全、不稳定、背景不理想、周期长，并需要进行大量的统计学工作。3.2 非放射性原位杂交(Nonisotopic ISH)非放射性标记弥补了放射性标记的不足，它的检测方法简单、快捷；在化学性质

14、上稳定，能通过几次免疫化学反应显著地增加杂交信号，从而提高灵敏度，杂交信号定位更准确。根据标记和检测特点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接法2种。直接标记法：正如同位素法标记探针一样，林秀琴等：荧光原位杂交技术(FISH)及其在植物分子细胞遗传学中的应用与展望-53-这类方法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测到。这种标记物大多为在激光下能发荧光的物质，故也叫荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization, FISH)。其常用的标记物有异硫氰酸荧光素(FITC)、氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)和罗丹明衍生物(TRITC)等。这些标记物掺入到探针

15、中后可用荧光显微镜直接观察杂交结果。如用不同颜色的荧光素标记不同的探针可同时定位2种以上的靶序列。快速、准确、颜色对比鲜明。与间接法相比，操作简单、结果背景干扰较少，但信号不能放大，其灵敏度相对较低9，并很快为间接法所替代。间接法是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到，必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上，通过特殊的检测方法，来显示杂交位点。这种方法最常用的标记物是生物素(Biotin)和地高辛(DIG)。生物素：用于间接标记法的标记物，也是最早使用的非放射性标记物。常用的生物素标记核苷酸有Biotin-16-dUTP、Biotin-11-dUTP、Biotin-14-dATP

16、和Biotin-7-dATp，这些核苷酸通过缺口平移或随机引物等方法掺入到探针中，杂交后通过免疫反应使生物素与荧光素标记的抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合，杂交信号可在荧光显微镜下观察，也可通过二抗使信号进一步放大。羟基毛地黄苷：商品名叫Digoxigenin，简称DIG，是20世纪80年代发展起来的一种新型非放射性标记物。常用标记核苷酸为digoxienin-11-dUTP，DIG标记系统中的所用标记方法和检测方法同生物素标记系统。生物素和地高辛标记系统都已得到广泛应用10，二者相比地高辛标记系统的灵敏度较高，因为在原核和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干扰，抗生物素蛋白对内源生物素存在

17、非特异性结合，使标记本底增高。4 靶染色体制片技术的发展4.1 中期染色体及制片方法压片法是植物染色体制片的常规方法，它简单且易操作，许多植物染色体核型分析、显带和原位杂交都是用这种方法完成的。但成功率较低，主要是因为染色体很难完全散开，容易产生重叠、变形、断裂等，此外细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，使原位杂交的信噪比增高。具大染色体的植物材料如普通小麦可用上述方法制片，但具小染色体的植物材料不适用此方法，因为获得的制片很难区分染色体上的各个部位。去壁低渗火焰干燥制片法必须考虑几个重要因素如前低渗处理时间、混和酶液的浓度、酶解时间和酶解温度以及后低渗处理时间等。低渗的目的在于使细胞吸收水分而膨胀

18、，染色体分散到细胞质中，在制片时便于染色体分散开，不同材料低渗的最佳时间不同，未经低渗处理的材料，细胞核膨胀的较小，染色体不易分开，而低渗处理过度，使细胞在低渗液中胀破，造成材料解体；酶解温度必须恒定，酶液浓度应控制在2%5%，根尖材料为2.5%左右，树木幼叶、幼芽可用5%左右；此外，酶解时间是个变化的因素，要根据材料的不同做适当调整，材料过大，会使酶解时间成倍增加，材料过多，会导致消化不足，酶液量过多会使酶解时间不易稳定。去壁低渗火焰干燥制片法又可以分为涂片法和滴片法，对于滴片法而言，上述因素同样重要，此外在滴片法中细胞悬液的制备也是实验成功与否的关键，Mouras等11用机械力将酶解的材料

19、捣碎后，100 ×g离心的方法获得悬液。此法不但手续麻烦，效果也并非很好。用静置片刻去沉淀和静置2030 min去上清液的方法，既简单且细胞收率也高，在上清液中有大量的被酶解离的细胞碎片，采用离心的方法，这部分碎片很容易与细胞混在一起，妨碍染色体展开。滴片法要求条件比较严，酶解和后低渗的时间必须合适。2种方法同压片法相比不但操作复杂而且费材料和成本。但是能够获得良好的效果12。4.2 减数分裂粗线期染色体在通常的原位杂交技术中，多以中期染色体(Metaphase chromosome)作为靶DNA的载体，由于受染色体结构高度凝缩的影响，其分辨率只能达到13 Mb的水平。然而这对于构建

20、高分辨率的DNA物理图谱来说，13 Mb的分辨率水平是还不够的，必须寻找分辨率更高的技术。而减数分裂的粗线期染色体(Pachytene chromosome)浓缩程度比中期染色体大为降低，其长度比相应的中期染色体大750倍，粗线期染色体FISH的分辨率可达100 kb左右。粗线期染色体还具有可识别的结构特征，包括着丝粒位置、短臂和长臂的比例、异染色质和常染色质的形态等，另外，粗线期染色体所在的细胞几乎不存在细胞壁，染色体延展良好，且同源染色-54-甘蔗糖业 2012年第1期 Sugarcane and Canesugar体配对提供了2个目标区域增加了一倍，以上这些特点说明了粗线期染色体可适用于

21、原位杂交及物理作图。Albini和Schwarzacher13在黑麦粗线期染色体上成功地进行了重复序列的定位研究。4.3 间期细胞核FISH与分裂期的染色体相比，间期细胞核的染色体凝缩程度很低，FISH的分辨力可提高到50 kb14。在人类间期核的FISH分析中发现，当2个探针的间距在100 kb至2 Mb时，间期FISH作图可用来测定染色体上2个相邻序列间的物理距离，不过，间期核缺乏可辨别的染色体结构，无法分辨单个的染色体，不能确定FISH信号相对于着丝粒、端粒和其它染色体标记的位置；而且在不同的细胞类型和染色体区域，染色质的凝缩模式和程度不同，必须有相应的对照标准。这些不利因素限制了间期核

22、FISH的应用。4.4 Fiber-FISH近年来，利用间期核制备高度伸展的DNA纤维(Extended DNA fiber)作为FISH的模板，已将分辨率水平提高到与常规分子生物技术Southern Blot分析相当的水平，在1 Mb的范围内，Fiber-FISH分辨力达到12 kb，灵敏度可达到700 bp15。该技术首先在人类细胞中获得成功16。其基本原理是，首先将单细胞悬浮液涂在载片上，然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏，让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维，在这种纤维上进行原位杂交。利用这一项技术，可以开展YAC、BAC、黏粒、噬菌体和质粒DNA克隆在DNA纤维上的线

23、性排列顺序并准确地构建出DNA物理图谱。4.5 超伸展的流式分拣植物染色体FISH最近Valárik等17发展了一种超伸展的流式分拣植物染色体(Super-stretched flow-sorted plantchromosome)高分辨FISH技术。流式分拣的大基因组(包括大麦、小麦、黑麦和鹰嘴豆)染色体在玻片上干燥后经温和的蛋白酶K消化和乙醇:冰醋酸(3:1)伸展，可获得比中期染色体长100倍以上的伸展的染色体纤维。由于这种超伸展的染色体之间不重叠，又保持了染色体的完整性，并有较大范围的伸展程度，可以用于研究染色体的超微结构，因此与Fiber-FISH技术相比具有一定的优势。此F

24、ISH技术特别适合于难以进行粗线期染色体FISH研究的大基因组。它的不足是需要用流式细胞仪分拣染色体。5 荧光原位杂交技术在植物分子细胞遗传学中的应用5.1 构建植物基因组(DNA)的物理图谱多数用于遗传作图的RFLP不能直接用于FISH物理作图。用RFLP从基因组文库筛选含大插入片段的BAC克隆，然后用这些克隆在粗线期和/或有丝分裂中期染色体上进行FISH物理作图，是一种十分有效的植物基因组(DNA)物理作图策略。由于用于作图的BAC克隆在遗传图上的位置是已知的，因此在得出这些克隆的物理图的同时即实现了物理图和遗传图的整合。值得指出的是，在玉米、大麦、小麦等大基因组植物中，RFLP标记筛选的

25、BAC克隆含有很多的重复序列，而含单一序列很少，在没有用非标记的重复DNA进行精确封阻的情况下，其中的重复序列(主要是反转录转座子)往往与基因组染色体的许多区域杂交，甚至涂染整个基因组18，因此大基因组难以用BAC-FISH进行基因组物理作图。Stephens等19采用高灵敏度的TSA-FISH技术，直接对大麦的RFLP(cDNA克隆)进行了物理作图尝试，显示这种技术可以作为大基因组FISH物理作图的一种可选择的方法。5.2 基因的功能与定位研究小麦5B染色体长臂上携带着控制小麦部分同源染色体配对的Ph基因，对该基因功能的研究有利于育种家对小麦进行遗传操作。为了了解不同的Ph的突变型控制细胞同

26、源配对的机制，使用GISH方法得到了比其它方法更进一步的研究结果20。Kenton等21将双粒病毒的DNA序列定位于烟草T基因组一个小染色体上，这是第一次观察到病毒DNA序列整合到植物基因组。病毒DNA插入序列物理作图在系统发育和植物进化研究中有特殊的应用，对农作物基因工程和植物基因组计划是有重要意义的，这是个特例。5.3 远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测远缘野生种具有许多对栽培种有利的基因，利用远缘杂交手段将有利基因的异源染色质渐渗到植物中形成新的种质，这是丰富植物种质资源的一条有效途径。运用基因组荧光原位杂交(Genome in situhybridization, GISH)方法跟踪检测

27、杂种后代外源染色体或片段，是一个快速、灵敏、准确、信息丰富林秀琴等：荧光原位杂交技术(FISH)及其在植物分子细胞遗传学中的应用与展望-55-的手段。它能对外源染色体或片段计数，显示它们的大小、位点和形态以及与寄主基因组染色体的重组，同时起到间接鉴定杂交品种真实性的作用。一般以标记的野生种基因组总DNA为探针，以栽培种亲本总DNA为封阻DNA，在杂种及其后代中期染色体进行杂交，通过信号的有无来判断是否有野生种染色质渗入。该技术，成功地鉴定了甘蔗种质创新杂种F1的真实性及回交后代染色体组成分析22-24。因此，无需经过基因表达产物来推断基因转移是否，就能检测整合于染色体内的和游离的外源染色质。5

28、.4 减数分裂时期染色体行为研究细胞遗传学中，研究减数分裂染色体的行为能够更深入地了解基因组与基因组之间的关系，但过去仅仅通过形态观察了解同源染色体配对，而现在通过GISH，不仅能观察到存在配对的同源染色体的来源，而且能观察到异源染色体易位互换重组现象。Parokonny等25应用GISH技术对烟草非对称杂种及其有性后代减数分裂中的基因组行为、染色体易位等进行研究。结果表明，染色体同源配对多在减数分裂各个时期都可以检测到包含双亲染色体片段的染色体易位现象，正常和重组染色体都能进入二分体和四分体。对非对称体细胞杂种自交和回交后代的分析表明，重组染色体可通过雌雄配子传递，正在进行减数分裂或减数分裂

29、以后也可发生染色体重组，即出现新的重组。总之，研究表明，通过基因组间易位，非对称杂种中一个亲本的染色体片段可以稳定地整合进另一亲本，并传递给有性后代。Gavrilenko等26对栽培番茄与野生马铃薯体细胞杂种(Lycopersicon esculentumSolanum etuberosum)的减数分裂进行分析，发现番茄染色体有优先丢失的趋势，对该体细胞杂种花药培养再生的4棵植株进行GISH分析表明：双亲染色体在不同花药再生植株中的贡献均不同，即1株为二倍体，双亲染色体各贡献12条，2株非整倍体，分别多了番茄、马铃薯的1条染色体，另1株为超四倍体，双亲各贡献26条染色体。5.5 探讨种的起源王

30、坤波等27以亚洲棉品种石系亚一号的gDNA为探针，采用棉属二倍体野生种瑟伯氏棉gDNA作封阻，对海岛棉品种“海7124”的体细胞染色体进行荧光原位杂交，结果清晰地观察出了显示红色荧光的26条染色体，这直观地说明了海岛棉的二倍体起源。有少数染色体呈现红蓝2种荧光信号，主要出现在染色体的长臂上。海岛棉6个随体，均在染色体的短臂上，其中一对较大，较大的在显示红色荧光的染色体上，但是随体本身显示兰色荧光。另外2对随体本身显示红色荧光，但是均位于较小的显示兰色荧光的染色体上。这些交互显示荧光的结果说明，在海岛棉的起源演化过程中，起源于2个亚组的染色体，彼此间发生了较大程度的交换。6 展望在甘蔗杂交育种中

31、，杂交后代的真实性鉴定是非常重要的，因为只有知道杂交后代是否真正含有亲本血缘，才能确定杂交利用的效果如何、杂交方法是否可行。荧光原位杂交技术是远缘杂交品种真实性鉴定的有效工具，它能准确地区分杂种含异源染色体及其组成，并且可用于减数分裂染色体异常行为的分析。原位杂交方法与其它真实性鉴定方法的相互印证，取长补短，将使作物远缘杂种的鉴定更加准确，为远缘杂交提供有力证据，从而缩短育种年限，提高甘蔗育种进程。甘蔗远缘杂交种在有丝和减数分裂过程中，双亲染色体在细胞内可能完全分开排列，以致在分裂结束后双亲染色体分别被包含在不同的细胞中，形成具有双亲染色体组的子细胞。所以，进一步应用荧光原位杂交技术对甘蔗远缘

32、杂交后代材料的有丝和减数分裂染色体行为进行研究，将对甘蔗育种具有重要的理论和实践指导作用。参考文献1 Gall J G, Pardue M L. Formation and detection of RAN-DAN hybrid molecules in cytological preparations GC.Proc Nat Acad Sci USA, 1969, 63：378-383.2 Lawrence J B, Villnave C A, Snger R H. Sensitive high-resolution chromatin and chromosome mapping in s

33、itu：presence and orientation of two closely integrated copiesof EMV in a lymphoma line J. Cell, 1988, 52：51-61.3 Pinkel D, Landegen T J, Coll Insc F J, et al. Fluorescencein situ hybridization with human chromosome specificlibraries：detection of trisomy 21 and translocations ofchromosome 4 GC. Proc

34、Natl Acad Sci USA, 1988,85：9138-9142.4 Trask B J, Pinkel D, Vamdenengh G. The proximity of-56-甘蔗糖业 2012年第1期 Sugarcane and CanesugarDNA sequences in interphase cell nuclei is correlated togenomic distance and perm its ordering of cosmidspanning 250 kilobase pairs J. Genomics, 1989, 5：710-717.5 Bedbro

35、ok J R, Jones J, ODell M, et al. A moleculardescription of telomeric heterochrosomatin in secalespecies J. Cell, 1980, 19：540-560.6 Bess P, Bess P, Mclntyre CL. Chromosome in situhybridization of ribosomal DNA in Erianthus sect.Ripidium species with varying chromosome numbersconfirms X=10 in Erianth

36、us sect. Ripidium J. Genome,1999, 42：270-273.7 Smpson P R, Newman M, Davies D R. Detection oflegume in gene DNA sequences in pea by in situhybridization J. Chromosoma, 1988, 97：454-458.8 Yan H M, Song Y C, Li L J. Physicial location of the ricePi-5(t), Glb and RTSV gene by ISH of BAC clones J.Wuhan

37、Univ. J Natur Sci, 1998, 3(2)：226-230.9 Forminaya A, Molnar S, Kim N S, et al. Characterizationof Thinopyrum distichum chromosomes using doublefluorescence in situ hybridization, RFLP analysis of 5Sand 26S rDNA, and C-banding of prents and additionlines J. Genome, 1997, 40：689-696.10 Benabdelmouna A

38、，Peltier D，Humbert C et al. Southernand fluorescence in situ hybridization detect three RAPD-generated PCR products useful as introgression marker inPetunuia J. Theor Appl Genet, 1999, 98(1)：10-17.11 Mouras A，Salesses G, Lut A. Protoplasts use in cytology:improvement of recent method in order to ide

39、ntifyNicotina and Prunus mitotic chromosomes J. Caryologia,1978, 31：117-127.12 金危危，李霞，李宗芸，等. 转基因水稻中外源基因的荧光原位杂交(FISH)分析J. 实验生物学报，2001，3(3)：163-168.13 Albini S M, Schwarzacher T. In situ localization of tworepetive DNA sequences to surface-spred pachytenechromosomes of rye J. Genome, 1992, 35(4)：551-5

40、59.14 de Jong J H, Fransz P F, Zabel P. High resolution FISH inplant-techniques and applications J. Trends Plant Sci,1999, 4：258-263.15 Fransz P F, A lonso C, Liharska T B, et al. High-resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana andtamato by fluorescence in situ hybridization to extendedDNA

41、fiber J. Plant J. 1996, 9：421-430.16 Heng H Q H, Squire, Tsui L C. High-resolution mappingof mammalian genes by in situ hybridization to freechromatin J. Proc Natl A and Sci USA, 1992, 89：9509-9513.17 Valárik M, Bartos J, Kovarova P, et al. High-resolutionFISH on super-stretched flow-sorted pla

42、nt chromosomesJ. Plant J, 2004, 37：940-950.18 Kato A, Lamb J C, Birchler J A. Chromosome paintingusing repetitive DNA sequences as probes for somaticchromosome identification in maize J. Proc Natl AcadSci USA, 2004, 101：1354-1355.19 Stephens J L, Brown S E, LapitanN L V, et al. Physicalmapping of barley genes using an ultra sensitivefluorescence in situ hybridization technique J. Genome,2004, 47：179-189.20 Benavente E, Orellana J, Fernandez-Calvin B.Comparative analysis of the meiotic effects of wheat ph1band ph2b m