肾脏缺血预适应对核因子-κB活性及细胞凋亡的影响

1、肾脏缺血预适应对核因子-B活性及细胞凋亡的影响 10-10-29 10:38:00 编辑：studa20作者：刘晓东， 曹长春, 武煜, 陈宇【摘要】 目的 通过建立大鼠肾脏急性缺血/再灌注(I/R)及缺血预适应 (I/P+I/R)模型，初步研究不同的缺血方式后肾脏核因子-B（NF-B）活性及二聚体亚单位的构成，探讨其减轻肾脏肾小管细胞凋亡的机制。方法 30只雄性SD大鼠摘除右肾、分离出左肾动脉后随机均分为3组（n=10）：A组为假手术组（Sham组），只分离左肾动脉，暴露术野60 min后直接缝合，24 h后取肾；B组为缺血/再灌注组(I/R组)，持续夹闭左肾动脉45 min，恢复血供24

2、h后取肾；C组为缺血预适应+缺血/再灌注组(I/P+I/R组)，左肾动脉夹闭2 min，松开5 min，重复3个循环，余同I/R组。分别用生化学方法检测血肌酐值的变化，组织病理学评价肾小管损伤程度评分，凝胶电泳迟滞分析检测肾组织NF-B/DNA 结合活性，超迟滞分析检测NF-B亚单位的构成，Tunel法检测肾小管上皮细胞的凋亡。结果 血清学检查及肾小管损伤评分提示，I/R组肾脏组织病理改变明显，损伤程度重，与Sham组比较，差异有统计学意义（P0.05）；与I/R组比较，I/P+I/R组损伤程度则明显减轻，差异有统计学意义（P0.05）。凝胶电泳迟滞分析检测肾组织NF-B/DNA结合活性I/P

3、+I/R组明显高于Sham组，差异有统计学意义 (P0.05)；超迟滞分析检测NF-B亚单位含有p65、p50；差异有统计学意义(P0.05)。结论 肾脏缺血预适应可通过抑制NF-B转录活性，减轻肾小管上皮细胞凋亡，从而发挥损伤保护效应。 【关键词】 肾脏；缺血预适应；核因子-B；细胞凋亡 Abstract: Objective To investigate the effect of different modes of renal ischemia on the activity of NF-B and the composition of dimeric subunit and to e

4、xplore the causative mechanism underlying the attenuated apoptosis of renal tubular cells with the establishment of animal models of acute renal ischemic/reperfusion (I/R) and ischemic preconditioning (I/P+I/R) in rats. Methods 30 male Sprague-Dawley rats were randomized into 3 groups (n=10 each) fo

5、llowing right nephrectomy and isolation of the left renal artery. Group A served as the sham-operated control, only with isolation of the left renal artery and suture following exposure for 60 min. Group B (I/R group) rats were subjected to ischemia for 45 min by clamping of the left renal artery an

6、d subsequent resumed blood supply. Group C (I/P+I/R) rats were pre-treated with 3 cycles of 2-minute ischemia and 5-minute reperfusion. All the rats were sacrificed at 24 h and nephrectomy was performed for analysis, including biochemical determination of the serum creatinine, histopathological eval

7、uation of the renal tubules, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) of renal NF-B/DNA binding activity, super shift assay of the composition of NF-B complexes in renal tissues and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay of the apoptosis of renal tubular epithe

8、lial cells. Results Serological examinations and scores of renal tubular injury revealed evident histopatological changes and serious injury in renal tissues in group B. Compared with the sham group, the differences were statistically significant (P0.05); Compared with group B, group C had markedly

9、attenuated injury with significant statistical differences (P0.05); EMSA results showed that the renal NF-B/DNA binding activity was significantly higher in group C than in group A, with significant statistical differences (P0.05); and super shift assay of the composition of NF-B dimeric subunit con

10、firmed the presence of p65 and p50 in group C, with significant statistical differences (P0.05). Conclusion Renal ischemic preconditioning attenuates the apoptosis of renal tubular epithelial cells via the inhibition of the transcriptional activity of NF-B, and thus has the protective effect on rena

11、l tissues. Key words: kidney; ischemic preconditioning; nuclear factor-B; apoptosis缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）是指脏器短暂缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）后能耐受更长时间的缺血，其内在的分子生物学机制尚未明了1。我们的前期研究表明，大鼠肾脏也存在缺血预适应的现象，具有一定的肾脏保护作用2。已有研究发现，细胞凋亡可能是缺血/再灌损伤的重要环节之一，而核因子-B（NF-B）是调控细胞凋亡的关键转录因子，可调控多种抗凋亡和促凋亡基因的转录3。

12、但对于肾脏缺血预适应的抗凋亡作用及胞内NF-B信号转导通路的活化特点尚未阐明。为此，本实验通过观察肾脏缺血预适应对NF-B转录活性及细胞凋亡的影响，探讨肾脏缺血预适应的抗凋亡机制，为肾脏缺血/再灌注损伤的防治提供重要的理论依据。1 材料和方法1.1 实验动物选择与分组健康雄性SD大鼠30只，体重240250 g，由南京医科大学实验动物中心提供。3%戊巴比妥钠麻醉后，所有动物均摘除右肾,稳定10 min；随机分成3组：A组为假手术组(Sham组，n=10)，只分离左肾动脉，暴露术野60 min后直接缝合，24 h后取材;B组为缺血/再灌注组(I/R组，n=10)持续夹闭左肾动脉45 min，恢复

13、血供24 h后取材；C组为缺血预适应+缺血/再灌注组(I/P+I/R组，n=10)，左肾动脉夹闭2 min，松开5 min,重复3个循环，余同I/R组。1.2 血清学检查大鼠腔静脉采血1 ml,立即用离心机3 000 r/min离心5 min,取上清液进行血肌酐值测定。1.3 组织学检查常规石蜡切片进行苏木精-伊红染色，光镜下观察其结构变化，对肾小管坏死程度进行评分。评分标准：每张切片在400倍镜下取外髓质部10个视野，依序观察左上、右上、左下、右下、中间。正常为0分，轻微损伤（受损肾小管 75%）为4分；以此作半定量分析并计算其平均值，作为肾小管坏死的标准评分指数4。1.4 凝胶电泳迟滞分析

14、(EMSA)测定NF-B/DNA结合活性提取肾组织核蛋白，以微量考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度，调至2 g/L，并于-70 保存。按试剂盒(Promega 公司)说明进行：在T4激酶作用下，将-32P-ATP (北京亚辉公司) 标记到NF-B位点ODN(探针)上后纯化。将核蛋白抽提物与标记的NF-B 探针反应，同时做特异性竞争结合试验。超迟滞分析（super shift assay）部分：将2 l抗NF-B亚单位抗体p65、p50、Rel-B、p52分别在加入探针前加入反应体系，室温孵育30 min，反应产物经4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕后，- 70 放射性自显影，X线胶片上的滞后带用凝胶成像

15、分析系统进行分析。以相对密度单位(RDU) 表示NF-B/DNA 结合活性。1.5 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)测定肾小管上皮细胞凋亡试剂盒由南京凯基生物公司提供。切片厚5 m,常规脱蜡入水，经3过氧化氢室温处理10 min以消除内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗3次，蛋白酶K消化30 min，然后用PBS缓冲液冲洗3次，加入TUNEL的反应液37孵育60 min，用PBS缓冲液冲洗3次后加亲和素辣根过氧化物酶，37湿盒孵育30 min，PBS缓冲液冲洗3次，加DAB试剂显色，苏木精染色，脱水、透明、封片。光镜下观察凋亡细胞，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，于凋亡细胞分布区域，随机

16、选取5个视野，用400倍光镜计数凋亡细胞，以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占总肾小管上皮细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)。1.6 统计学处理所有数据均以s表示，各组间检验用方差分析(F检验和q检验)。所有数据使用SPSS 11.0 统计软件进行分析。P0.05被认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组大鼠血肌酐的变化I/R组和I/P+I/R组大鼠血肌酐值与Sham组比较都有明显升高，差异具有统计学意义（P0.01），但是I/P+I/R组血肌酐值明显低于I/R组，差异具有统计学意义（P0.05）。见表1。表1 各组大鼠血肌酐、肾小管损伤积分及AI的比较（略）2.2 各组大鼠肾小管损伤积分的变化I/R组肾脏组织病理改变明显，受损最严重的部位是皮髓交界处、外髓内带的近端小管，主要表现为小管上皮细胞脱落、刷状缘消失和肾小管阻塞。与I/R组比较，I/P+I/R组损伤程度则明显减