新型降钙素的制备及活性测定

1、    新型降钙素的制备及活性测定        摘要新型降钙素（一种人降钙素类似物）基因工程菌nCT/pGEX-2T/E.coliBL21经20L规模发酵,离心收集细胞，反复冻融裂解细胞，裂解液经G-Sepharose-4B亲和层析纯化得到融合蛋白。融合蛋白进行磺酸化和溴化氰裂解后，用S-Sepharose 纯化得到新型降钙素前体，其纯度为97.6%。选用羧肽酶Y(CPY)将其前体转化为C-末端酰胺化的新型降钙素，转化率为34%。转化液经HPLC分离纯化得到新型降钙素。大鼠

2、体内降血钙试验表明新型降钙素具有显著降血钙活性。关键词新型降钙素；工程菌发酵；分离纯化；降钙活性Production and Bioactive Assessment of Recombinant Novel Human Calcitonin AnalogueZhang Yubin,Wu Wutong, Wang Ming, Wu Tao,He Nan,Guo Changying（School of Biopharmaceutics, China Pharmaceutical University,Nanjing 210009）AbstractThe genetic engineering s

3、train nCT/pGEX-2T/BL21 was cultured in 20L fermentation tank. The cells were collected by centrifugation and lysed by repeated cycles of freezing and thawing. The fusion protein was purified by G-Sepharose-4B affinity chromatography. Fusion protein, GST-nCT,was cleaved by cyanogen bromide to release

4、 the precursor of nCT. The precursor of nCT was isolated by S-Sepharose-4B chromatography.The purity of the precursor was greater than 97.8%. Then the precursor of nCT was identified by MS detection. The precursor was converted into novel hCT analogue with C-terminal amidation by Carboxypeptidase-Y

5、（CPY）. The novel hCT analogue has the hypocalcemic bioactivity in rats.Key WordsCalcitonin analogue，Genetic engineering, Hypocalcemic activity鲑鱼、猪和人降钙素以及鳗鱼降钙素类似物(Asu 1.7-calcitonin)已用于临床治疗骨质疏松、Pagets病和高血钙症。鲑鱼降钙素的生物学活性最高，它是人降钙素活性的50倍，但非人源的鲑鱼降钙素长期使用会产生抗体。我们以人和鲑鱼的降钙素为先导化合物，借助计算机辅助设计了一种新型降钙素，以期获得活性高、半衰期

6、长、抗原性低的新型降钙素。选用基因工程法成功地构建了表达新型降钙素的基因工程菌nCT/pGEX-2T/E.coli BL211。pGEX-2T是一种原核融合型表达载体，能高效表达外源蛋白2，3。外源基因克隆在谷胱甘肽转移酶(GST)基因3-末端,所表达的融合蛋白可以用偶联有谷胱甘肽的亲和层析柱(G-Sepharose-4B)一步纯化得到融合蛋白。融合蛋白经磺酸化和溴化氰裂解，离子交换和RP-HPLC纯化，制得新型降钙素前体。降钙素C-末端的酰胺化是生物活性所必需的，我们选用羧肽酶Y催化新型降钙素前体转化为具有C-末端酰胺化的新型降钙素nCT，大鼠体内降血钙试验表明它具有显著的降钙活性。1材料1

7、1菌株和培养基基因工程菌nCT/pGEX-2T/BL21（本室构建）。LB培养基%： Bacto-Tryptone 1.0, Bacto-Yeast Extract 0.5，NaCl 1.0, pH7.0（高压灭菌）。12试剂GST Affinity Purification Kit(瑞典Pharmacia公司产品)。S-Sepharose Fast Flow Resin（瑞典Pharmacia公司产品)。溴化氰(BrCN)(美国Sigma公司产品)。羧肽酶Y(德国Boehringer-Mannheim公司产品)。鲑鱼降钙素标准品(Sandoz公司产品)。人降钙素标准品（Sigma公司产品)。

8、血清钙测定试验盒(上海荣盛生物技术有限公司)。低分子量标准蛋白(Gibco, BRL)，其它常规试剂均为国产或进口分析纯。2方法21工程菌发酵将基因工程菌nCT/pGEX-2T/BL21单菌落接种于50ml LB+Amp中，37恒温振荡培养约15h。次日，将此种子按1%接种量，接种到摇瓶(100ml LB/500ml摇瓶)中，37通气培养至A600nm=0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L。继续培养4h，离心收集菌体。并用此条件在20L发酵罐（含12L培养基）进行发酵，大量制备菌体。22融合蛋白纯化4将离心收集的发酵液菌体按20g量分装到离心杯中，然后将离心杯放入干冰/乙醇冰

9、浴中10min，再放入冰水浴中2min，反复3次后，每瓶加入PBS 40ml混悬，放于冰水浴中并间歇搅拌1h，12000×g离心30min，收集上清，并经SDS-PAGE检测融合蛋白。上清液通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，PBS洗涤、10mmol/L谷胱甘肽（50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗脱，收集洗脱液，并进行SDS-PAGE检测。合并洗脱液，透析后再进行一次亲和层析，洗脱液透析后用PEG浓缩，融合蛋白质浓度调整为10mg/ml。23融合蛋白质的磺酸化5向上述制备的融合蛋白溶液中加入2.5mg连四硫酸钠/mg GST-nCT，5.2

10、mg亚硫酸钠/mg GST-nCT和0.1ml 1mol/L Tris HCl(pH8.0)/ml反应液，室温下避光搅拌反应12h，使蛋白质中半胱氨酸残基-SH氧化成磺酸基团。反应后透析除盐、PEG浓缩，离心除去白色沉淀物。24融合蛋白的溴化氰裂解6磺酸化融合蛋白中加入尿素和盐酸，使其终浓度分别为8mol/L和50mmol/L。然后加入溴化氰(1mg BrCN/mg蛋白)，室温避光搅拌反应5h，加1倍ddH2O终止反应，SDS-Tricine-PAGE检测7。25降钙素前体纯化5裂解液加入S-Sepharose Fast Flow Resin柱中，用10mmol/L HCl洗涤至A280nm0

11、.05，然后用洗脱液(10mmol/L HCl,100mmol/L NaCl)洗脱，紫外检测器检测，收集出峰处流出液，冷冻干燥，再经RP-HPLC纯化。运用电喷雾质谱测试鉴定。26新型降钙素的制备8，9将10mg新型降钙素前体加入到10ml pH9.5的氨溶液(浓NH3*H2O用HCl调节)中，加入约10l DMSO使多肽完全溶解。然后加入100l 50mol/L的羧肽酶Y溶液，37反应1h，加入TFA(终浓度1%)摇荡混匀，终止反应。用2mol/L NaOH调节至pH8.0，加入半胱氨酸，使终浓度为5mmol/L，37反应1h以恢复二硫键，RP-HPLC纯化、收集各出峰处流出液，减压蒸馏，冻

12、干,进行氨基酸组成分析和质谱鉴定，以确定新型降钙素组分。27新型降钙素的活性测定10根据英国药典收载的大鼠降血钙法测定新型降钙素的生物活性，Wistar大鼠(185-200g)，雌雄兼有，禁食过夜，不限饮水。实验前随机分组，每组8只，共6组，一组用于空白溶剂对照，一组用于鲑鱼降钙素对照，一组用于人降钙素对照，另外三组用于新型降钙素样品不同剂量的测试。对照品及样品稀释溶剂为0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 3.6)，腹部皮下注射给药。注射后1h，乙醚麻醉大鼠，毛细管刺破大鼠眼眶静脉丛，使血液滴入小离心管中，每鼠约取1015滴，3000r/pm离心20min。取血清50l加入钙显色剂(甲基百里

13、酚蓝，MTB)3.0ml，混匀，放置5min，用610 nm波长测定，空白管调零，读取测定管和标准管的吸光值(A)，计算血清中钙含量。3结果31融合蛋白的发酵与纯化基因工程菌经发酵培养后，离心收集菌体，用干冰/乙醇反复冻融法裂解菌体，可有效地释放细胞内所表达的融合蛋白。菌体裂解液经G-Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE分析检测可见融合蛋白被有效地纯化（1），凝胶扫描结果表明融合蛋白经二次亲和层析后纯度达95.6%。(a)SDS-PAGE of the fusion protein1. Standard protein marker2.Fusion protein puri

14、fied by first affinity chromatography3.Total nCT/pGEX-2T/E.coli BL21 lysate(b)SDS-PAGE of purified fusion protein1. Standard protein marker2. Purified fusion protein by second affinity chromatographyFig 1SDS-PAGE analysis of purified fusion protein32新型降钙素前体制备融合蛋白经磺酸化后用BrCN裂解。裂解液用SDS-Tricine-PAGE检测可见

15、融合蛋白裂解成不同大小的片段，且主要集中在30006000D之间。裂解的蛋白用S-Sepharose Fast Flow Resin纯化。收集出峰处洗脱液。HPLC分析表明新型降钙素前体纯度达97.6%。电喷雾质谱分析结果表明分子量正确，磺酸化的降钙素前体理论Mr为3666，谱中出现了M/Z 3796的基峰，它为M+6Na+的准分子离子峰(2)。Fig 2Electrospray mass spectrometry of nCT precursor33新型降钙素的制备HP 1050,Vydac protein & peptide C18 250x10.0 mmA:0.1% TFA-H2

16、OB:0.1%TFA-CH3CN,Gradient 025%Fig 3Purification of nCT by HPLC新型降钙素前体经羧肽酶Y处理后，HPLC分析结果见3，有3个主峰，分别收集3个峰的流出液、浓缩、冻干。进行氨基酸组成分析和质谱分析，发现保留时间为8.720min的组份为新型降钙素，转化率为32%，其氨基酸组成分析结果表明除Pro、Thr、His三个残基外，其它氨基酸残基的组成比例与理论值一致。质谱分析表明在理论MrM+3413.8处，有相应的峰群。34新型降钙素的降血钙作用实验大鼠腹部皮下给药1h后，测其血清钙浓度。表1结果表明新型降钙素高、中、低剂量均有降钙活性，且呈

17、剂量效应关系。5讨论降钙素是由32个氨基酸残基组成的多肽激素，在E.coli中表达极易被降解，采用融合表达可以避免被降解。pGEX融合表达载体，表达量高，且可用亲和层析法纯化融合蛋白，给后处理提供了很大的方便。融合蛋白是一种胞内蛋白，分离纯化前必须破壁。曾采用超声波破碎法，它虽可使细胞有效地破壁，但细胞内蛋白均全部释放到裂解液中，杂蛋白含量高，致使亲和纯化步骤效率减低。改用反复冻融法裂解细胞可选择性地释放出表达的融合蛋白4，减少了杂蛋白对亲和层析的影响，非常有效地提高了亲和层析步骤的效率。Tab 1The concentration of rat plasma calciumSampleBlo

18、odCa2+ (mg/100ml)Hypocalcemicactivity(%)control9.55±0.33Human Calcitonin（500ng/100g）9.33±0.352.3Salmon calcitonin（10ng/100g）8.21±0.4114.0Novel calcitonin（10ng/100g）8.90±0.316.8（20ng/100g）8.55±0.3510.5（30ng/100g）8.27±0.4313.4为了有效地使融合蛋白能被溴化氰裂解，并减少副反应，裂解前先将蛋白中的半胱氨酸残基磺酸化5。裂

19、解后的多肽性质各异，一些多肽在离子交换柱吸附后的洗涤过程中被洗掉，而另一些多肽在洗脱液(10 mmol/L HCl,100mmol/L NaCl)洗脱时仍吸附在柱上，仅有新型降钙素前体被洗脱下来。因此裂解液通过阳离子交换法一步纯化可得到磺酸化新型降钙素前体6。运用基因工程法制备新型降钙素，其C-末端的酰胺化必须通过后处理使之转化为脯氨酰胺。国外已尝试使用体内的-AE酶(-Amidating Enzyme)，国内目前还难以得到。本研究选用羧肽酶Y作催化剂，虽然转化率不高，但价格便宜，容易得到，且已成功地用于一些多肽末端酰胺化的制备8。本研究中转化率达32%，高于国外文献报道值，这很可能是由于我们

20、在Pro后设计的Arg作为离去基团优于文献报道的Leu、Phe、Val9。 张玉彬（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）吴梧桐（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）王?（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）吴滔（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）何南（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）郭长缨（中国药科大学生物制药学院，南京 210009）参考文献1，张玉彬，吴 滔，王?，等.新型降钙素的基因合成与克隆表达.药物生物技术，1999，6（3）1292，Smith,D B, Johnson,K S,Single-step purification

21、 of polypeptides in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene,1988,67313，刘惠，李载平，俞贤明.乙型肝炎病毒表面抗原S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报，1994，26（5）：5134，Johnson B H, Hecht M H, Recombinant proteins can be isolated from E.coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology，1994,1213575，Chan,W W C,A method for complete S-sulfonation of cysteine residues in proteins.Biochemistry，1983,8(12)4276，Ray M V L, Duyne P