急性放射对小鼠骨髓造血细胞及基质细胞层粘附功能的影响

1、    急性放射对小鼠骨髓造血细胞及基质细胞层粘附功能的影响        骨髓造血干细胞的自我复制、增殖、更新、维持正常造血功能，是通过造血干细胞表面的粘附分子与基质细胞上的配体或细胞外基质蛋白结合而实现的1。我们观察8Gy 60Co 射线照射对小鼠骨髓造血细胞与体外培养的骨髓基质细胞层粘附能力的影响，以进一步探讨急性放射损伤引起骨髓造血抑制的原因。 材料和方法1实验动物清洁级昆明小鼠24只，同批鼠龄78周，体重1820g，雌雄各半，由同济医科大学动物中心提供，随机分为照射

2、组与非照射组，每组12只。2照射剂量60 Co 射线一次全身均匀照射，每只小鼠吸收剂量为8Gy，吸收剂量率为0.43Gy/min。3外周血白细胞计数和骨髓有核细胞计数照射后7天从尾静脉取血，采用标准方法计数外周血白细胞。取小鼠双侧股骨，用RPMI 1640液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞并用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞层，洗涤2次，加入适量培养液充分混匀，制成悬液，用台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上，计数骨髓有核细胞数。4骨髓成纤维祖细胞(CFU-F)培养按常规方法2：建立CFU-F培养体系，再加已制备好的骨髓细胞悬液，使细胞浓度达2×106/ml。将上述细胞悬液1ml接种于24孔培养板中

3、，置于37含7%CO2饱和湿度培养箱中培养，每周半量换液一次。1214天于倒置显微境下计数成纤维细胞集落，第4周基质细胞层形成后作粘附能力测定。5骨髓有核细胞对骨髓基质细胞层粘附能力的测定28天基质细胞层形成后，用RPMI 1640液轻轻冲洗2次以弃去悬浮细胞，在培养的基质细胞层中，加入浓度为5×106/ml的小鼠骨髓有核细胞悬液1ml(含20%小牛血清)。在培养箱中培养2小时后，用RPMI 1640培养液轻轻冲洗2次，收集并计数未粘附的骨髓有核细胞，骨髓有核细胞对骨髓培养基质细胞层的粘附能力(1-未粘附细胞数/5×106)×100%。6统计学方法采用t检验。结果

4、1各组外周血白细胞及骨髓有核细胞数比较照射组外周血白细胞计数与骨髓有核细胞数均显著低于未照射组(附表)。附表组别鼠数WBC(×109/L)骨髓有核细胞(×107/根股骨)未照射组127.05±0.451.71±0.03照射组121.91±0.11*0.87±0.10*     * 与未照射组相比，P0.01 2急性放射对小鼠成纤维细胞集落的影响未照射组小鼠成纤维细胞集落数为95.0±7.5，照射组为38.4±3.1，两组相比有显著性差异(P0.01)。3急性放射对小鼠骨髓有核

5、细胞及骨髓基质细胞层粘附能力的影响照射组基质细胞层对未照射组骨髓有核细胞粘附能力(47.61%±4.30%)及照射组骨髓有核细胞对未照射组基质细胞层粘附能力(51.15%±6.00%)均显著低于未照射组有核细胞对未照射基质细胞层粘附能力(69.51%±5.57%)，差异有显著性(P0.01)。讨论本实验中小鼠经8Gy 射线照射后7天，其外周血白细胞计数及骨髓有核细胞计数较未照射组显著下降，说明成功地建立了急性放射损伤小鼠模型。我们用改良的Dexter长期骨髓培养方法观察急性放射损伤对小鼠骨髓基质细胞生长的影响，发现照射组小鼠成纤维细胞集落平均数显著低于未照射组平均

6、数，由于成纤维细胞是基质细胞的主要成分之一，该结果提示，基质细胞的抗辐射能力是有限的，60Co射线8Gy可损伤和抑制小鼠基质细胞的生长。我们将未照射组小鼠的骨髓有核细胞分别加入到照射组与未照射组的体外培养基质细胞层上，照射组基质细胞层对骨髓有核细胞的粘附能力明显低于未照射组，从而提示放射损伤了骨髓造血基质，使造血基质对造血细胞粘附能力下降。而将照射组小鼠骨髓有核细胞加入到未照射组小鼠体外培养的基质细胞层上，照射组小鼠骨髓有核细胞对未照射组基质细胞层的粘附能力明显低于未照射组小鼠骨髓有核细胞对未照射组基质细胞层的粘附能力。说明急性放射损伤了造血细胞的粘附能力。本实验说明急性放射不仅抑制基质细胞生

7、长，而且损伤造血细胞与造血基质的粘附能力，培养的骨髓基质细胞层的粘附能力受基质细胞数量、基质细胞表达的粘附分子及其分泌的基质蛋白影响，因此，我们将进一步用流式细胞仪检测基质细胞表面粘附分子的表达。骨髓正常造血有赖于造血细胞与基质的直接粘附作用，这种粘附作用由造血细胞及基质细胞表面的粘附分子和基质蛋白介导，它不仅影响造血细胞在骨髓微环境中迁移、分化、增殖，而且影响细胞因子分泌与释放3，因此，无论是骨髓造血细胞粘附能力改变，还是造血基质粘附能力的改变，都会损伤骨髓造血功能。经静脉注射的骨髓干细胞移植最终归巢于骨髓，定位于骨髓后增殖，分化，成熟，并再次释放入外周血循环，该过程都需要干细胞与骨髓基质的粘附作用。在临床上