狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立

1、 中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2439【经验交流】狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立吕新军, 唐青, Herv éBourhy , 马学军11213(11中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京100052; 21Pasteur I nstitute Paris, 75724关键词狂犬病病毒; 中和抗体; 快速荧光灶抑制试验中图分类号R183. 9文献标识码C 文章编号1004-8685(2010 02-0439-

2、03RFF I T 是WHO 推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准实验方法1, 美国疾病预防控制中心狂犬病实验室、法国巴斯德研究所狂犬病实验室等国际知名狂犬病研究机构都采用该方法进行狂犬病病毒中和抗体检测, 保护水平的中和抗体效价应015I U /ml 。RFF I T 主要应用于狂犬病疫苗的免疫学效2, 3果评估和狂犬病病毒中和抗体替代检测试剂和方法的评4, 5估, 是狂犬病疫苗及中和抗体诊断试剂评价的关键技术。近5年来我国每年因狂犬病死亡25003500人6, 仅次于印度位居全球第二。面对国内严峻的狂犬病疫情, 国家卫生职能部门强化了狂犬病的免疫预防措施, 一些大型狂犬病免疫干预项目逐步具备

3、实施条件, 国内狂犬病病毒中和抗体检测需求快速增长, 在我国疾病预防控制体系内建立RFF I T 十分必要。RFF I T , 推广应用的主要障碍先建立了RFF I T 检测体系, 为狂犬病疫苗大量应用的免疫学检测和监测提供了可靠的技术支持。1材料与方法111病毒、细胞系和标准血清113待测样品编号为CL 、HY 、JY 、DJL 、WXG 、T L 的6份待测血清来自本实验室健康研究人员, 均具有完整和清晰的背景资料, 其中编号为T L 的研究人员从未接受过狂犬病疫苗免疫, 其血清作为阴性对照血清, 另外5人接受过狂犬病疫苗暴露前免疫, 其血清作为待测阳性血清。114细胞悬液的制备25c m

4、 方瓶培养的BSR 细胞铺满单层后倒掉培养液, 0125%胰酶液和0102%Versene 液1:3混合作为消化液, 以2m l 消化液洗涤细胞2次, 加入2m l 消化液消化, 当细胞开始2, 5m l DM E M 培养液, , 1, 根据计数结果补加6E 养到1×10细胞/ml 。每个25c m 1m l 上述细胞悬液, 用10%F BS 的DM E M 7m l 于375%C O 2孵箱孵育7296h 。115病毒种子的制备25c m 方瓶需上述细胞悬液1m l, 其它规格的方瓶所需细胞悬液体积以此类推。按照感染指数(MO I 为011计算所需2已知病毒滴度的C VS -11

5、上清的体积, 将CVS -11上清加入方瓶内混合均匀, 375%C O 2孵箱孵育1h, 期间每510m in 摇匀1次, 补足10%F BS 的DME M 培养液, 375%C O 2孵箱孵育72h, 收获病毒上清, 测定病毒滴度, 大于10FF U /ml 可以使用。连续感染3代细胞, 每代收获的病毒6已知病毒滴度的狂犬病病毒标准攻击毒株CVS -11上清和BSR 细胞系由本实验室保存, 30I U /ml 标准血清冻干品由英国国立生物制品和控制标准品研究所提供。112试剂和仪器DME M 培养液购自Gibico 公司, 胎牛血清(Fetal Seru m of Bovine, F BS

6、购自四季清生物制品有限公司, 100U /ml 青霉素和链霉素双抗混和液、0125%胰酶液、0102%Versene液由本所配液室提供, 抗狂犬病病毒核蛋白荧光抗体购自M illi pore 公司。普通倒置光学显微镜为OLY M P US CX41型, 正置荧光显微镜为OLY MP US I X51型。基金项目十一五科技重大专项-传染病检测技术研究-传染病病原体诊断和组合检测技术(2008ZX10004-002 ; 中美新发和再发传染病合作项目(2007-2008I D :9141211-2 ; 法国赛诺菲-巴斯德公司中国大陆学者赴法培训资助项目(2008年度作者简介吕新军(1973- , 男

7、, 医学博士, 副研究员, 主要从事病毒病预防控制工作。3通讯联系人, E -mail:maxj2004yahoo1com 1cn上清按照015m l/管分装, -70冰箱保存, 分别作为第1、2、3代病毒种子。116病毒种子80%感染量的测定在96孔检测板上选择1行每孔加10%F BS 的DME M 培养液50l; 在另1块96孔稀释板上选择1行每孔加70l 10%F BS 的DM E M 培养液, 取70l 第3代病毒种子上清加入第1孔, 进行1:2倍比稀释, 每个稀释度取50l 加入96孔检测板上各孔中; 每孔加入1×106细胞/ml 的细胞悬液50l, 混匀, 375%C O

8、 2孵箱培养24h 。常规进行F AT 检测, 确定80%细胞被感染的病毒稀释倍数。117待测样品的检测在1块96孔检测板上纵向选择7行每孔加10%F BS 的DM E M 培养液100l, 第1行设为标准血清稀释系列, 第2行设为阴性对照血清稀释系列, 每份血清取50l 加入单行第1孔内, 进行1:3倍比稀释, 最后1孔弃去50l; 取出第3代病毒种子, 融化, 按照80%感染量进行稀释, 前述每孔加50l 病毒稀释液, 375%CO 2孵箱孵育1h 进行中和作用; 每孔6加入1×10细胞/ml 的细胞悬液50l, 混匀, 375%C O 2 440中国卫生检验杂志2010年2月第

9、20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2孵箱培养24h 。常规进行F AT 检测, 计算待测样品狂犬病病毒中和抗体滴度。118中和效价计算以Reed &M uench 法公式和M icr os oft Excel 表函数功能为基础设计被测样品中和效价计算方法, 固定标准血清50%细胞感染量前/后1孔内细胞感染比例, 输入待测血清50%细胞感染量前/后1孔内细胞感染比例即可自动得出待测血清中狂犬病病毒中和抗体效价值(表1 。表1中和效价Excel 表联锁计算公式待测血清X =

10、高于50%分界点的细胞感染量x =低于50%分界点的细胞感染量r =稀释比例214检测体系稳定性和有效性的初步分析5份样品3次重复检测变异系数011, 说明检测体系稳标准血清70, 00X =高于50%分界点的细胞感染量30, 00x =低于50%分界点的细胞感染量3, 00r =稀释比例60, 0040, 003, 00定性良好, 可用于其他样品检测。从样品背景信息可知, 5人均采用赛诺菲-巴斯德公司同一生产批号的韦尔伯人用狂犬病疫苗实施0、7、28d 暴露前免疫注射, 首剂注射后45d 采血检测狂犬病病毒中和抗体。编号WXG 的个体在规定的3针注射外于14、21d 加强注射了2针, 结果显

11、示其中和抗体效价较高。编号为JY 的个体在接受狂犬病疫苗免疫后也存在中和抗体效价较低的情况, 显示与其自身免疫状态有关。编号C L 、HY 、DJL 的个体产生的中和抗体效价适中, 达到了预期的保护作用。检测结果较好地反映了个体的真实免疫反应状况, 说明了检测体系的有效性。3讨论F =低于50%分界点的血清稀释倍数81, 00F =低于50%分界点的血清稀释倍数729, 002, 1550%分界点对应血清稀释倍数140, 3050%分界点对应血清稀释倍数3, 101262, 670, 15变异系数中和效价2, 292结果211病毒种子的滴度本室保存的CVS -111110FF U l, 按照M

12、O I =011连续3, 、27分别为814×10FF U l ×/ml FF U l, U 以上。212第3代病毒种子80%感染量第3代病毒种子在25稀释度(32倍稀释 时80%细胞被5感染, 对应病毒滴度为6125×10FF U /ml 。因此, 在本室RF 2F I T 检测中第3代病毒种子稀释32倍后作为攻击病毒用于中和作用。213待测样品中和抗体效价F AT 检测结果显示检测板上标准血清稀释系列第6孔内细胞感染比例为40%, 第7孔内细胞感染比例为60%, 将上述结果输入中和效价计算公式内标准血清对应栏内。阴性对照血清稀释系列各孔内细胞感染比例差别很小,

13、 均在50%以上。将其余待测血清稀释系列50%细胞感染量前/后孔内细胞感染比例输入中和效价计算公式内得出相应中和抗体效价(表2 。表25份暴露前免疫人员血清中和抗体效价测定结果CL第1次检测第2次检测第3次检测平均值标准差变异系数狂犬病患者病死率几乎100%, 迄今尚无有效治疗方法和药物, 进行狂犬病暴露前和暴露后免疫是防制人间狂犬病的重要措施, 人体接种狂犬病疫苗后狂犬病毒中和抗体效价1015I U /ml 即可认为达到有效保护水平。国内每年使用狂犬病疫苗12001500万人份, 我国疾病预防控制体系迫切需要开展狂犬病疫苗应用后的免疫学检测和监测。目前世界卫生组织向全球推荐的狂犬病病毒中和抗

14、体检测试验包括RFF I T 和, 在17I T RFF I T 检测体系经过初步验证能够真实, 可应用于狂犬病病毒中和抗体检测, 拟扩大检测样品数量, 完善体系灵敏度、特异性、稳定性、重复性等主要指标的评价。由于完成一次RFF I T 最少需要2d 时间, 而且操作技术要求较高7, 因此研究者推出一些替代性的E L I S A 检测试剂或是改良试验方法来检测狂犬病病毒中和抗体效价。RFF I T 是评价这些试剂和改良试验方法的金标准, 已有的研究显示在商业化的狂犬病病毒中和抗体替代检测试剂中灵敏度和特异性与RFF I T 接近的非常少见5。国内个别地方疾病预防控制机构在狂犬病疫苗免疫后的血清

15、中和抗体检测中也有采用8E L I S A 法的, 但是很少通过RFF I T 进行过评价。我们在国内疾病预防控制体系内建立和推广RFF I T 将在很大程度上改变这种状况, 减少狂犬病疫苗免疫项目实施效果监测中的盲目性。本室在RFF I T 建立中结合国内疾病预防控制体系的实际工作条件对美国疾病预防控制中心和法国巴斯德研究所的实验方案进行了改进, 从而使得操作更加容易进行, 便于向地方疾病预防控制机构推广, 初步应用结果显示这些改进并不影响新的RFF I T 检测体系的效能。实际上针对RFF I T 的改进一直在进行, 法国P éhar p r éD 等在RFF I T

16、结果的自动化判读方面获得成功9, 日本Kha wp l od P 等应用表达绿色荧光蛋白的r HEP -GFP 重组狂犬病毒作为攻击病毒进行RFF I T, 无需进行F AT 即可直接观察结果10。本室RFF I T 结果观察采用与荧光显微镜配套的电脑成像系统进行, 避免了直接进行荧光观测导致的视力损伤, 也显示技术进步为RFF I T 操作提供了更大的便利性。(下转第458页 458中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2Ep idem i ol,

17、 2002, 12(6 :433-440117W hyatt RM , BarrDB 1Measure ment of organophos phate metabolites inpost partum meconium as a potential bi omarker of p renatal exposure:a validati on study J 1Envir on Health Pers pect, 2001, 109:417-420118Ostrea E M Jr, Biela wskiD M, Poseci on NC Jr, et al 1A co mparis on o

18、f in 2fant hair, cord bl ood and meconiu m analysis t o detect fetal ex posure t o envir on mental pesticidesJ1Envir on Res, 2008, 106(2 :277-83119Enrique M O strea J r, Da wn M B ielawski, Norbert o C Poseci on J r, etal 1Combined analysis of p renatal (maternal hair and bl ood and neo 2natal (infa

19、nt hair, cord bl ood and meconium matrices t o detect fetal exposure t o envir onmental pesticides J 1Envir on Research, 2009, 109(1 :116-122120A sa B radman, Dana B Barr, B irgit G Claus Henn, et al . Measure 2ment of pesticides and other t oxicants in a mni otic fluid as a potential bi omarker of

20、p renatal exposure:a validati on study J 1Envir on Health Pers pect, 2003, 111(14 :1779-1782121W essels Denise, Dana B Barr, Pauline Mendola 1U se of bi omarkers t oindicate exposure of children t o organophos phate pesticides:i m p lica 2ti ons f or a l ongitudinal study of children s envir onmenta

21、l health J .Envir on Health Pers pect, 2003, 111:1939-19461(收稿日期:2009-11-04的可行性研究J 1中国工业医学杂志, 2002, 15(4 :205-207110刘国红, 刘西平, 杨克敌1产妇体内有机氯农药残留对血中4种生殖激素水平的影响J 1环境与职业医学, 2005, 12(6 :519-522111Luzardo OP, Mahtani V, Tr oyano J M , et al 1Deter m inants of organo 2chl orine levels detectable in the a mni

22、 otic fluid of women fr om Tenerife Island (Canary Islands, Spain J 1Envir on Res, 2009, 109(5 :607-613112姚新民, 周志俊1长期接触低剂量有机磷农药对人体健康影响的研究进展J 1环境与职业医学, 2008, 25(4 :409-411113Jaga K, Dhar mani C 1Sources of exposure t o and public health i m p li 2cati ons of organophos phate pesticidesJ 1Pan Am J Pub

23、lic Health, 2003, 14(3 :171-185114Denise W , Dana B Barr, Pauline Mendola 1U se of bi omarkers t o indi 2cate exposure of children t o organophos phate pesticides:i m p licati ons for a l ongitudinal study of children s envir onmental health J .Envi 2r onment Health Pers pect, 2003, 111:1939-1946115

24、孙运光, 周志俊, 顾祖维1有机磷农药生物标志物的研究进展J 1劳动医学, 2000, 17(1 :58-60116RoysterMO, H ilborn ED, Barr D , et al 1A p il ot study of gl obal posi 2ti oning syste m /geographicalinfor mati on syste m measurement of resi 2dential p r oxi m ity t o agricultural fields and urinary organophos phate metabolite concentrat

25、i ons in t oddlersJ 1Exposure Analysis Envir on(上接第440页参考文献1World Health O rganizati on 1WHO expert consultati on on rabies, 2004,First Report; WHO technical report series #9311World Health O rgani 2zati onM1Geneva, S witzerland, 200512Shanbag P, Shah N, Kulkarni M , et al 1Pr dren against rabies:p

26、re -on chick 2bryo cell vaccine ( or ver (P VRV J 1Hum 4 :-36913Manicka ma R, R, et al 1Post exposure p r oph 2ylaxis (PEP of rabies -infected I ndian street dogs J 1Vaccine, 2008, 26(51 :6564-656814Shi ota S, Mannen K, Matsumot o T, et al 1Devel opment and evaluati onof a rap id neutralizing antibo

27、dy test f or rabies J 1J V ir ol Methods, 2009, Epub ahead of p rint15W elch RJ, Anders on BL, L it w in C M 1An evaluati on of t w o commercial 2ly available EL I S A s and one in -house reference laborat ory EL I S A forthe deter m inati on of human anti -rabies virus antibodiesJ 1J Med M icr obi

28、ol, 2009, 58(Pt 6 :806-16宋淼, , 冯子健, 等-年中国狂犬病流行特征分J 1, (6 :584-58717asnie , F 1ools f or rabies ser ol ogy t o moni 2t vaccinati on in domestic and wild carni 2J 1B i ol (Basel , 2006, 125:91-9418李怀昕, 汪武新, 谢远辉1830例狂犬疫苗接种后抗体检测结果分析J 1中国热带医学, 2006, 6(12 :2153-215419P éhar pr éD, Cliquet F, Sagn éE, et al 1Co