甲酰肽受体2多效调控巨噬细胞分化与肿瘤发生

1、甲酰肽受体 -2（FPR-2 ）多效调控巨噬细胞分化与肿瘤发生一、背景资料：1、 甲酰肽受体 -2（FPR-2）2、 ROS-MARK-NF-kB 信号通路3、NF-kB二、全文翻译摘要 癌细胞能产生 丰富的化学引诱物和生长因子，比如巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF/CSF-1 ）、单核细胞趋化蛋白 -1（ MCP-1/CCL2 ）。这些因子和引诱物会招募单核细 胞、巨噬细胞和其它炎性细胞来促进肿瘤的生长发展。 基于对这个机制的了解我们知道， 靶 向肿瘤细胞和调控肿瘤微环境在设计抗肿瘤治疗方案时非常重要。 在这里， 我们的研究显示 出，不论是否注射了脂多糖（LPS）,血清淀粉样蛋白一A （

2、SAA ）和抗菌肽（LL-37 ）都会 刺激M-CSF和MCP-1表达；相反，脂氧素-A4（ LXA 4）和膜联蛋白-A1 （ ANXA1 ）也会 通过人（HepG2）和鼠（H22）肝癌细胞（HCCs）来抑制LPS-诱导的M-CSF和MCP-1的 产生。然而，相同的是 LXA4 、ANXA1 、SAA 和 LL-37 效应的产生均依赖于它们细胞表面 共同的受体一一甲酰肽受体 -2（ FPR-2）和随后的 ROS-MAPK-NF-kB 信号通路。另外，我 们的研究结果显示 LPS 可以使巨噬细胞向 IL-10 低表达、 IL-12 高表达的 M1 型转化，而 M-CSF+MCP-1和FPR2激动

3、剂可以使巨噬细胞向IL-10高表达、IL-12低表达的 M2型转化。在那方面，虽然调节信号转导与转录激活因子 -3（STAT3）、 LXA4 和 ANXA1 的磷酸化作用 可以诱导巨噬细胞向 M2a 型、 M2c 型分化并显示出抗肿瘤发生的活性。然而， SAA、 LL-37 和 M-CSF+MCP-1 可以导致细胞向 M2b 型、 M2d 型分化加重体内外实验中 HCC 的侵犯现 象。我们的研究发现，FPR2在肿瘤免疫编辑中发挥着可观的多效调控作用。关键词 甲酰肽受体 -2 巨噬细胞集落刺激因子 单核细胞趋化蛋白 -1 巨噬细胞 肿瘤发 生1 介绍一个多世纪以前， Virchow 基于肿瘤组织

4、中存在白细胞而假定炎症和肿瘤有某种联系。 从那时以来， 大量的流行病学研究和实验都支持了这一观点。 在许多条件下， 肿瘤发生发展 在很大程度上受控于炎症。 较新的研究证据也表明损坏消除炎症的内生机制可以导致慢性炎 症并促进肿瘤生长。巨噬细胞是肿瘤免疫编辑中的关键因素。 巨噬细胞可以分为两种亚型， M1 型和 M2 型。 这种分类方法是基于它们对于 IL-10、 IL-12 的表达量不同。 M1 型有着有效地杀菌性并促进 Th1 响应，而 M2 型则支持与 Th2 相关的效应。 M2 型进一步可以分为 M2a、 M2b、 M2c 、 M2d 四种。 M2a、 M2b 型巨噬细胞发挥免疫调节功能、

5、驱动 Th2 响应；而 M2c 在抑制免疫 反应和促进组织重构方面起决定性作用；M2d型，也叫做肿瘤相关巨噬细胞 TAMs，它在肿瘤驱动信号，如 M-CSF/CSF-1 、 MCP-1/CCL2 的作用下在肿瘤部位累积，它可以在肿瘤耐 受方面起积极作用，也会损害抗肿瘤免疫治疗的疗效。甲酰肽受体-2（ FPR2，也被称为甲酰肽样受体-1或脂氧素A4受体ALX ），是G蛋白偶 联受体（GPCRs）中化学引诱物受体亚族中的一员。它有复杂的功能性质，部分原因是它的高杂交性， 部分原因是激活该受体后， 根据其不同起源和高度结构多样性的配体可以或刺激 或抑制炎症反应。另外，由于 FPR2 在炎症中的重要作

6、用， FPR2 也不可避免的被牵连到癌 症中。 阐明 FPR2 在肿瘤发生中的确切机制是很重要的，它能使我们更好地理解炎症与肿瘤 病理生理，并使我们设计出更加有效地抗肿瘤治疗策略。在我们的研究中，我们在人（HepG2）和鼠（H22 ）肝癌细胞（HCCs ）的M-CSF和MCP-1 表达水平上观察了四种结构不同的 FPR2 激动剂的作用： LXA4 、 SAA 、 ANXA1 和 LL-37 。此外，这些结果均向我们提供了一个全新的角度来研究 FPR2 在肿瘤免疫编辑中可 能的调节机制。 我们还发现这些激动剂能明显的使巨噬细胞向 M2 型转化， 并在体内外显示 出在 HCC 肿瘤发生上出现相反的

7、作用。2 结论FPR2 激动剂对 HCCs 上产生 M-CSF 和 MCP-1 的作用如图 1 所示，在 HepG2 和 H22 细胞中， M-SCF、MCP-1 的 mRNA 和蛋白表达水平都 由于 SAA、LL-37 而显著增加。 然而， 给予 LXA4 和 ANXA1 后 M-CSF 和 MCP-1 没有显著 改变。另外，与空白相比，内毒素脂多糖（ LPSs）显著增加了 M-CSF和MCP-1的mRNA 及蛋白表达水平，而 LXA4 和 ANXA1 逆转了 LPS 影响 M-CSF 和 MCP-1 表达的作用。有 趣的是， SAA 和 LL-37 增加了 LPS 诱导的 M-CSF 和

8、MCP-1 的累积（图 S1）。 这些结果表 明不同的 FPR2 激动剂可以在 HCCs 的 M-CSF 和 MCP-1 累积中起到相反的作用。FPR2 激动剂对 M-CSF 和 MCP-1 表达水平的调控作用部分归因于 NF-kB 的活化和表达 众多周知，转录因子核因子 -kB（NF-kB ）在炎症和消除炎症过程中起重要作用。我们 同意上述结论。在用 SAA、LL-37 或者 LPS 处理的 HepG2 细胞中，我们观察到 NF-kB p50 表达有所增加。相反，LXA4和ANXA1能够减少NF-kB p50的表达。LXA4逆转LPS诱导 的NF-kB p50的增加（图2a,上方）。同样的，

9、用SAA、LL-37或LPS处理后，NF-kB的结 合活性也显著增加， 而给 LXA4 或 ANXA1 后观察不到明显改变。 SAA 能够提高， 而 LXA4 能够完全的抑制 LPS诱导的NF-kB的转录活性（图2a，下方）。另外,用 RNA 干扰使 NF-kB p50 基因沉默会抑制 NF-kB 的结合活性,也会部分削弱 SAA 诱导的 M-CSF 和 MCP-1 生成，而对 LXA4 处理的 M-CSF 和 MCP-1 表达无效（图 2b 和2c）。这表明NF-kB参与FPR2调节的M-CSF和MCP-1的生成过程。注： beta-actin 是内参抗体。ROS 和 MAPKs 参与 FP

10、R2 对 M-CSF 和 MCP-1 累积的调节作用我们知道很多物质激活 NF-kB 是通过 ROS 和/或 MAPKs 调控的，于是我们想是否 FPR2 激动剂的作用也是通过 ROS和/或 MAPK信号通路实现的呢？如图 3a中所显示的，当单独 暴露给 LPS、 SAA 和 LL-37 以后， ROS 的水平增加。单独暴露给 LXA4 和 ANXA1 后，没 有改变ROS的水平，但LXA4能使LPS诱导增加的 ROS下降。磷酸化的 ERK（ pERK ）在 暴露给SAA和LL-37后显著增加。SAA还可以诱导磷酸化的 p38（ pp38）活化，而LL-37 对pp38没有作用。相反，LXA4

11、和ANXA1都会抑制ERK和p38磷酸化（图3b）。为了判断在 FPR2-NF-kB-M-CSF/MCP-1 信号轴中 ROS 在处于 MAPK 的上游还是下游， 我们使用 DPI （ ROS 生成抑制剂） 、 PD98059（ pERK 特异性抑制剂）还有 SB203580 （ pp38 抑制剂）。如图 3c、 3d 所示，抑制 ROS 和 MAPks 使 NF-kB p50 和 SAA 诱导产生的 M-SC F、 MCP-1 的表达下降。值得注意的是， DPI 减弱了 ROS 的生成和 SAA 诱导的 pERK 及 p p38 的表达水平。而 MAPK 的抑制剂 PD98059 和 SB2

12、03580 不能使得 ROS 下降。这表明 R OS 是位于 MAPKs 的上游的。同样有趣的是，在给 LXA4 后，不论 PD98059、 SB203580 还 是 DPI 都没能明显的改变 ROS 和 MAPKs 的水平。 这些实验结果都表明 FPR2 能够通过 RO S-MAPKs-NF-kB 信号通路双向调节 M-CSF/MCP-1 的水平。注： 2,7 dichlorofluorescin diacetate. 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯Arbitrary units 任意单位SAA 和 LXA4 对 M-CSF/MCP-1 的累积调控作用依赖于 FPR2如图4a

13、、4b所示，相比于杂小发卡 RNA群，SAA上调M-CSF和MCP-1的作用明显 的在FPR2沉默后（FPR2小发卡RNA）群受到阻碍。在用 FPR2小发夹RNA转染HepG2细 胞后， LXA4 也不能抑制 LPS 诱导的 M-CSF 和 MCP-1 的表达。SAA和LXA4也都分别通过激活 Toll样受体（TLRs ）和白三烯-B4受体（BLT1 ）来发 挥作用。在我们的研究中， E5564 （ TLR 抑制剂）和 U-75302 （ BLT1 拮抗剂）分别抑制与 1 25I-SAA和3H-LXA4的结合（图4c、4d）。E5564和U-75302 1卩M的剂量就足以分别抑制 其与125I

14、-SAA和3H-LXA4的结合。同样有趣的是，在用E5564 1卩M刺激30分钟后，我们加入未标记的 SAA，结果SAA逆转了与125I-SAA的进一步结合（图 4c）。同样的，在加 入U-75302后，LXA4也能逆转与3H-LXA4的结合（4d）。接下来我们发现，未标记的SAA 以浓度依赖性方式竞争结合125I-SAA ；LXA4 不影响 125I-SAA 的结合活性， 而是取代其与3H-LXA4的结合。SAA也不能逆转与 3H-LXA4的结合（图 4e、4f）。这些实验证明 LXA4 和 SAA 激活 FPR2 通过结合到 HepG2 细胞的不同位点上，并因此在调节 M-CSF、 MCP

15、-1 表达水平上起到相反的作用。FPR2 激动剂对巨噬细胞分化的作用毫无疑问，调节 TAM 表型应该是一种抑制肿瘤进展的有效治疗策略。巨噬细胞相关细 胞株U937已经在很多体外实验中作为 TAMs的代替物。在这里，我们通过在体外给以上几种 激动剂来检测U937巨噬细胞的分化情况。如图 5a中所示的，与对照组相比，LPS抑制IL-10并刺激IL-12p35生成，这是M1型的表征，然而 M-CSF+MCP-1和FPR2激动剂使得U937细胞 高表达IL-10低表达IL-12p35，即M2型表征。百日咳毒素（PTX ）会阻碍这些改变，这表明 所有这些激动剂刺激巨噬细胞分化是通过激活G蛋白偶联受体（G

16、PCR）实现的。另外，我们发现FPR2拮抗剂WRW4损害LXA4/ANXA1和SAA/LL-37对于诱导IL-10和IL-12p35的作用 （图5a）。这些结果都表明LXA4/ANXA1和SAA/LL-37通过激活细胞膜上的 FPR2来使巨噬细 胞向M2型转化。接着又产生一个疑问那就是 FPR2激动剂和M-CSF+MCP-1会诱导出哪种亚型的细胞？ IL-12p40是IL-23的亚型，其他异二聚体细胞因子有着和IL-12不同的生物学效应。IL-23在应对感染和癌症发展的炎症反应中很重要。在我们的研究中，IL-23p19表达可以被LPS、M-CSF+MCP-1、SAA 和LL-37 增加，而不受

17、 LXA4 或ANXA1 的影响（图 5b）。在一系列动物模型上都很显著的促癌活性的炎性细胞因子有：IL-6、IL-1beta和T N F alpha 。这些因子中任何一个都有可能作为治疗的靶点。在我们的研究中，这些因子的 表达水平也都被 LPS、M-CSF+MCP-1和SAA上调。相比对照，LL-37增加IL-6和IL-1beta的表 达，而不影响TNFalpha蛋白积累。IL-23p19, IL-6和IL-1b在对照组、LXA4组和ANXA1组相 同。但TNFalpha被LXA4和ANXA1 抑制（图5b）。这些结果都表明 SAA和LL-37促癌。我们 的发现也提出了一种可能，即LXA4和

18、ANXA1抑制肿瘤生成是通过减弱肿瘤微环境中巨噬细胞的 IL-6、IL-1bata 和 TNFalpha 表达。CCL17、CCL1、CXCL13 和 CXCL8（IL-8）生成分别与 M2a、M2b、M2c和 M2d 单核细胞 激活有关。并且是先天免疫和获得性免疫中单核巨噬细胞介导的调节轴中很重要的一部分。如图5c所示，给M-CSF+MCP-1、LXA4和ANXA1后，CCL17水平明显增加，而 CCL1无明显 变化。CXCL13和CXCL8都受到M-CSF+MCP-1的促进。在FPR2激动剂中，LXA4和ANXA1 促进CXC13但不促进CXCL8分泌。相反SAA和LL-37促进CXC13

19、促进CXCL8，而不影响 CXCL13。也就是说LXA4/ANXA1 、SAA/LL-37和M-CSFtMCP-1分别时巨噬细胞向 M2a型、 M2c型、M2b型和M2d型转化。FPR2介导的M2型分化是由于STAT3磷酸化作用STAT3激动剂促进炎症和肿瘤发生。活化的STAT3会诱导信号转导抑制因子-3（ SOCS3）抑制剂的表达，随后会引起 STAT3信号负反馈。为了检测 FPR2激动剂和M-CSF+MCP-1在巨 噬细胞中是否能影响 STAT3活性，所以使用U937细胞和LXA4、SAA、M-CSF+MCP-1和/或 NSC74859（ pSTAT3抑制剂）共培养。检测 SOCS3和 p

20、STAT3的表达情况（图6a）。FPR2激动 剂诱导SOC3表达，然M-CSF+MCP-1和NSC74859均对SOCS3无效。只有LXA4诱导STAT3磷 酸化，并且这种现象可以被 M-CSF+MCP-1和NSC74859明显抑制。同样有趣的是，SAA不能 改变由LXA4激动的pSTAT3。这表明SOCS3的表达可能还会被除了 STAT3以外其他的信号通 路诱导。因为STAT3被发现可以调节免疫活性和巨噬细胞功能，也就是说被激活的STAT3很可能在巨噬细胞分化中起到重要作用。CCL17, CCL1, CXCL13和CXCL8的分析情况显示在图6b中。一方面，STAT3抑制剂NSC74859能

21、缓解由LXA4引起的CCL17、CXCL13蛋白的积累。 M-CSF+MCP-1显著增加了 LXA4诱导的CCL17和CXCL13分泌，而不SAA+LXA4 组和LXA4 组的CCl7和CXCL13没有明显差别。另一方面，LXA4不影响SAA诱导的CCL1表达，而减少M-CSF+MCP-1诱导的CXCL8的分泌。此外，这些结论表明pSTAT3是LXA4诱导的M2a+M2c 型分化和M-CSF+MCP-1诱导的M2d型分化的核心。然而，M-CSF+却不涉及到SAA调控的CCL1 分泌中。FPR2参与HCC肿瘤生成如图7a中所示，SAA和LL-37组的HepG2细胞增殖显著增加（4.23倍；5.1

22、倍），而LXA4 和ANXA1组显著抑制（0.63倍；0.57倍）。为了说明在体外 HCC增殖过程中，巨噬细胞的作 用，我们在U937条件培养基中经多种方法处理后共培养HepG2细胞，与对照组比较，在既不加未处理U937也不加ANXA1处理的U937条件培养基的共培养中 HepG2细胞没有增殖，而 用M-CSF+MCP-1处理的和LL-37处理的U937条件培养基中明显增加（图7b）。在肿瘤微环境中，HIF-1 （缺氧诱导因子-1 ）和COX-2 （环氧合酶-2）对肿瘤细胞存活、 增殖、血管生成和转移有重要作用。 在我们的研究中，HIF-1alpha在对照组（未处理）和ANXA1 刺激的Hep

23、G2细胞组不能被检测到，而出现在LL-37刺激的HepG2细胞中（图7c）。在与M-CSF+MCP-1处理的或LL-37处理的U937条件培养基中，HIF-1alpha也被诱导出来。ANXA1 处理的U937条件培养及不能改变 COX-2水平，而LL-37和与LL-37处理的U937条件培养基共 培养则显著增加COX-2在HepG2细胞（图7c）。这些观察到的现象通过皮下移植小鼠模型被更进一步的证明了。如图7d、7e所示，与对照组（H22-耐受小鼠）相比，解剖后观察到的肿瘤组织的重量和体积在ANXA1组下降，而在LL-37组上升。另外，肿瘤组织的HIF-1alpha和COX-2表达被ANXA1

24、抑制，被LL-37增加（图 7f ）。然而，肿瘤浸润巨噬细胞（TIMs ）的密度在ANXA1组合LL-37组增加（图S3），而仅 有WRW4既不改变肿瘤的重量和体积，也不改变HIF-1alpha和COX-2的在肿瘤中的表达，但WRW4可以适度损害巨噬细胞的在原位的浸润并显著抑制肿瘤微环境中ANXA1和LL-37对 肿瘤生成巨噬细胞浸润的效应 （图7d-f和S3）。这表明ANXA1和LL-37是通过在体内激活FPR2 来调控肿瘤生长的。讨论FPR2是第一个典型的PTX敏感的七次跨膜GPCR，它可以与跨膜脂质配体、蛋白和多肽 结合。一方面，FPR2的抗炎药理活性已经被完全评估了，包括很多方面。而它

25、最显著地抗 炎药理作用应该归结为它的内源性配体，比如LXA4和ANXA1。LXs是从花生四烯酸生成的内源性类花生酸类物质，发挥着抗炎的作用。糖皮质激素诱 导的对磷脂酶A2的抑制作用能够被一种被称为脂皮质蛋白-1或者膜联蛋白-A1的第二信使调节。很多研究者已经将糖皮质激素诱导的炎症抑制作用和 ANXA1 依赖性通道相结合，在 单核细胞和巨噬细胞中都是的。 有趣的是， 糖皮质激素和非甾体抗炎药都被证明有治疗肿瘤 的潜力。因此，ANXA1和LXs都可能作为COXs的抑制剂扮演抗炎和抗癌的作用。另一方面，通过结合其他配体，如 SAA和抗菌肽LL-37，FPR2也被认为发挥着一种促炎 的作用，如化学趋向

26、性、激活人中性粒细胞、单核细胞和 T细胞的作用和放大先天性和获得 性免疫反应的作用， 并因此调节化学趋向性、 树突细胞分化、 肥大细胞下调和刺激血管生成 等。因此，它是一个能够调节炎症和免疫的有争议的受体。在很多实体瘤中，M-CSF和MCP的过度表达与不良预后密切相关。这里，我们发现FPR2激动剂SAA和LL-37促进ROS产生、MAPKs磷酸化、NF-kB表达和反式激活以及最终在 HCCs 中M-CSF和MCP-1的生成。然而，LXA4和ANXA1通过ROS-MAPKs-NF-kB信号通路促进 mRNA和蛋白水平M-CSF和MCP-1积累。通过配体结合分析、PTX、RNA干扰、WRW4拮抗等技术手段，我们发现四种FPR2激动剂和通过与它们共同的细胞膜受体FPR2上的不同位点结合发挥着完全相反的作用。肿瘤发展和转移的倾向不止由于癌细胞的基因突变，