一、重要植物病原物分子检测技术、种类鉴定及其

1、一、项目名称：重要植物病原物分子检测技术、种类鉴定及其在口岸检疫中应用二、推荐单位：浙江省科学技术厅三、项目简介：外来病原生物入侵对我国农林业生产造成了巨大威胁，本项目针对我国植物病原物检测先进技术缺乏，普遍存在“检测难、鉴定难、防控难、标准缺”的问题开展了系统研究，取得以下创新成果。1. 建立了重要植物病原物分子检测技术 首创了基于科属特异性简并引物的马铃薯Y病毒科、马铃薯X病毒属、麝香石竹潜隐病毒属和葱X病毒属成员RT-PCR检测和基因组全序列扩增技术，建立了16种高风险病毒和8种高风险真菌的基于PCR原理的检测方法，完善了伞滑刃属线虫的ITS-RFLP鉴定方法，创建了伞滑刃属线虫分组鉴定

2、方法和分组及各组分种检索表，建立了单条线虫DNA提取新方法以及松材线虫R型和M型株系区分方法。2. 系统鉴定、命名、截获了一大批重要植物病原物 从全国18个省44种作物和6种进口植物种苗中鉴定了59种植物病毒，其中上述4科（属）新种9种（占全球同期鉴定的新种14%），中国新纪录种11种，更正命名6种。测定26种病毒基因组全序列，其中19种为首次测定，20种被NCBI认定为相关病毒的参考序列，占同期认定的同科（属）病毒参考序列总数24%。口岸截获鉴定线虫新种25种，更正命名2种，其中鉴定伞滑刃属线虫新种16种，测定新序列59条，占全球鉴定的该属新种（31种）和测定新序列的50%以上。首次研究了葱

3、X病毒属分类标准，发现明确了一些植物病毒基因组分子特征。 3. 建立了高风险种苗中线虫的检疫处理技术 综合应用物理和化学防治技术，明确了进出境种苗中线虫检疫处理的药剂种类、剂量、处理时间和温度等技术参数，建立了安全、高效、成本低廉的检疫处理技术。4应用情况 国家质检总局根据本项目研究成果发布警示通报7次，执行境外谈判和预检7次。本项目先后承担全国检验检疫系统和国家认监委培训班12次，共培训1226人次。建立的技术在全国检验检疫系统广泛应用，近3年59个应用单位共截获检疫性植物病原物53种1466批次，节约了取样费、试剂费、货柜和船舶滞港费累计2.37亿元，缩短了检测周期，提高了种苗成活率和价值

4、。本项目发表论文101篇，其中SCI收录45篇，已被他引592次，出版专著2部，授权国家发明专利10项，制订国家标准8项、行业标准9项，获得省科学技术奖一等奖2项。本项目的意义不仅在于建立的植物病原物分子检测技术具有重要实用价值，成为我国外来植物病原物检疫检验或早期预警的核心技术和国家标准，改变了我国检疫检验领域缺少自主检测技术的被动局面，而且已被我国检疫检验部门广泛应用，截获了大量外来检疫性植物病原物，为维护国家生物安全做出了重要贡献。同时发现鉴定了一大批植物病毒、线虫新种，明确了其基因组特征，发表的论文已被国内外同行大量引用，并得到国际组织和同行高度评价，丰富了植物病原学理论，对国际植物病

5、原学发展起到了引领作用，处于国际领先水平。四、主要完成人及技术贡献陈剑平：排名第1，浙江省农业科学院，研究员，项目主持人，提出学术思想并争取立项，制定该项目的研究目标和总体技术方案，组织项目实施，提供学术和技术指导，完成项目总结。合作出版专著1部、发表论文50篇，其中通讯作者49篇，SCI收录27篇，完成成果总结。曾获：“大麦和性花叶病毒在其禾谷多黏菌介体内的发现和增殖的研究”1995年国家科技进步奖一等奖；“我国大麦黄花叶病毒株系鉴定、抗源筛选、抗病品种应用及其分子生物学研究”2001年国家科技进步奖二等奖；“我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病病原、发生规律及其持续控制技术”2004年国家科技进

6、步奖二等奖；“禾谷多黏菌及其传播的小麦病毒种类、发生规律和综合防治技术应用”2005年国家科技进步二等奖。均为第一完成人。 陈 炯：排名第2，宁波大学，研究员，建立植物病毒检测和基因组扩增技术，完成大部分病毒种类鉴定和基因组研究。合作出版专著1部、发表论文50篇，参与成果总结。曾获：“我国大麦黄花叶病毒株系鉴定、抗源鉴定、抗病品种应用及其分子生物学研究”2001年国家科技进步二等奖，排名第二。“禾谷多黏菌及其传播的小麦病毒种类、发病规律、抗源筛选及其分子生物学研究”2005年国家科技进步二等奖，排名第三。 陈先锋：排名第3，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，负责组织项目第二完成单位宁波检

7、验检疫科学技术研究院有关本项目研究工作，完成部分线虫、病毒、真菌种类鉴定工作，合作出版专著1部、发表论文22篇、专利3项、国家和行业标准15项，参与成果总结。 顾建锋：排名第4，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，完成线虫检测方法和种类鉴定工作，主编专著1部，合作发表论文37篇、专利2项、国家和行业标准5项，参与成果总结。段维军：排名第5，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，完成真菌检测方法和种类鉴定工作，合作出版专著1部、发表论文13篇、专利1项、国家和行业标准5项，参与成果总结。郑红英：排名第6，浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，助理研究员，参与10多种病毒种类鉴定和基因组研

8、究，合作发表论文25篇。闻伟刚：排名第7，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，参与多种病毒检测方法研制，合作发表论文6篇、专利7项、国家和行业标准5项。程 晔：排名第8，浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，副研究员，参与项目的管理和总结工作，参与10多种病毒种类鉴定和基因组研究，合作发表论文5篇。崔俊霞：排名第9，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，参与多种病毒检测方法研制和种类鉴定工作，合作发表论文5篇、专利2项、国家和行业标准4项。 张慧丽：排名第10，宁波检验检疫科学技术研究院，高级农艺师，参与真菌检测方法研制和种类鉴定工作，合作发表论文11篇、专利2项、国家和行业标准13项

9、。五、主要完成单位及创新推广贡献浙江省农业科学院：全面主持本项目的实施，创建了有关植物病毒检测和全基因组扩增技术，测定了有关病毒的基因组全序列，发现鉴定了一批植物病毒新种。参与了有关技术的培训与推广。并为本项目的植物病毒研究提供人力、财力和研究设施，为宁波检验检疫科学技术研究院技术人员和研究生开展该项目的技术培训提供条件。宁波检验检疫科学技术研究院：负责承担了检疫性植物病毒、线虫和真菌检测方法和检疫处理技术的研究，截获了一批检疫性植物病毒、线虫和真菌，鉴定了一批线虫新种，开展了技术培训、出国预检和谈判，推广了建立的有关病原物检测和检疫处理技术，收集了有关应用证明。为上述工作的开展提供了人力、财

10、力和研究条件。宁波大学：负责承担了部分植物病毒鉴定和检测技术的研究，鉴定1个植物病毒新种，参与建立多种植物病原的分子检测技术。为第一和第二完成单位开展相关项目的研究招收和培养研究生。为第二完成单位人员开展相关项目的研究提供思路设计和技术培训。为上述工作的开展提供了人力、财力和研究条件。六、推广应用情况1根据本研究结果，制定国家标准和行业标准。本项目制定了8项国家标准和9项行业标准，填补了我国在这些检疫性病毒、线虫、真菌相关检测技术标准方面空白。2. 根据本研究结果，国家总局发布有关警示通报。本项目在全国口岸中首次截获日本短体线虫、葡萄茎枯病菌等13种检疫性有害生物，国家总局据此向全国各出入境检

11、验检疫口岸发布警示通报7个，通报有关鉴定和检测技术，告知全系统加强有关疫情监控，严防其传播扩散，保护国家利益。3. 应用本研究结果，开展国外谈判、预检和技术交流。本项目参加人员分别赴加拿大、巴西、马拉维、日本、意大利、澳大利亚等国进行相关贸易谈判和种苗预检工作，促进了我国相关植物产品的出口，保护了国家利益，维护了生态安全。4应用本研究结果，开展技术培训。本项目先后承担全国检验检疫系统 “进境种苗中线虫检测技术” 等培训班12次，共培训1226人次，提高了口岸植物病原检测能力。2012年受国家认监委委托，承担线虫检测鉴定能力验证1次，检验检疫系统30家实验室参加，有效提高了口岸线虫检测鉴定能力。

12、通过培训工作，项目研发的方法体系、标准、专利、试剂盒等已在全国范围内得到了示范推广和应用。5有关技术在出入境检验检疫机构和企业应用情况。采用本项目建立的针对病毒、线虫和真菌的检测鉴定技术，通过对我口岸出入境植物上的病毒、线虫、真菌进行有效的检测和防控，节约了取样费、试剂费、货柜和船舶滞港费，并且缩短了检测周期，提高种苗成活率，提升了种苗价值。截止2013年12月21日，本项目已经收到59个单位应用证明，其中出入境检验检疫机构56个，企业3个。共截获检疫性植物病原物53种1466批次，其中病毒14种302批次，线虫21种666批次（其中全国首次截获2种2批次，玻利维亚短体线虫、朱顶红短体线虫），

13、真菌18种498批次。2011年产生经济效益7458.704万元，2012年产生经济效益8606.098万元，2013年产生经济效益7657.676万元，共计23722.478万元。6. 社会效益与间接经济效益本项目建立的一系列植物病原物分子检测、鉴定和基因组全序列扩增技术，获得国家发明专利10项，制订国家标准8项（其中5项已颁布）、出入境检验检疫行业标准11项，突破了长期以来“无标可依”、难以准确鉴定的检测瓶颈，大幅度提高了我国植物病原物检测、鉴定的速度，灵敏度和可靠性，提升了高风险植物病原物入侵早期的检测预警能力，为我国口岸一线植物检疫提供了重要技术保证。在全国首次截获检疫性植物病毒1种、

14、线虫7种和真菌5种，截获检疫性植物病毒151种次、线虫82种次和真菌94种次，显著提高了口岸种苗高风险植物病原物的检测检出率，对有效防范外来植物病原物入侵做出来重要贡献。建立的出口种苗线虫综合防疫体系，突破了高风险种苗线虫防控关键技术难题，节约了大量除害成本，减少了出口种苗销毁造成的损失，为成功破解国际种苗贸易技术壁垒提供了技术支持。鉴定植物病毒59种（新种9种）、线虫新种25种和真菌8种，改变了长期以来我国研究者发现鉴定植物病毒和线虫新种鲜少的状况，也为全面认识我国植物病原物种类、分布、发生规律和防治研究提供了科学依据。该成果的应用，大大加快了植物及其产品通关速度，同时显著降低了有害生物的传

15、入和危害风险，保护了农林业生产安全，促进了口岸植物及其产品进出境业务，已在59家口岸单位和企业推广使用，取得了显著的经济、社会和生态效益。此外，本项目培养博士5名，硕士12名。七、主要知识产权证明目录知识产权类别知识产权具体名称国家（地区）授权号授权日期证书编号权利人发明人发明专利油棕猝倒病菌的LAMP检测试剂及试剂盒中国ZL201210116514.42013-11-271312162宁波检验检疫科学技术研究院张慧丽徐 瑛陈先锋王建峰发明专利啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂及检测方法中国ZL201110319087.52013-8-281262900宁波检验检疫科学技术研究院郭

16、立新段维军闻伟刚发明专利一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法中国ZL201110141018.X2013-7-311244470宁波检验检疫科学技术研究院顾建锋王江岭发明专利油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用中国ZL201110356095.72013-6-191221949宁波检验检疫科学技术研究院张慧丽闻伟刚徐 瑛王建峰发明专利南芥菜花叶病毒RT-LA MP检测试剂及制备方法和应用中国ZL201110148678.02013-4-241181358宁波检验检疫科学技术研究院闻伟刚王建峰崔俊霞张吉红杨文潮发明专利烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用中国ZL201110148284.52013-4-31168827宁波检验检疫科学技术研究院闻伟刚王建峰崔俊霞张吉红杨文潮发明专利一种单条线虫DNA的快速提取方法中国ZL201110049172.42013-1-61120917宁波检验检疫科学技术研究院顾建锋王江岭张建成发明专利香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PC R检测试剂及制备方法和应用中国ZL200910099586