大肠杆菌染色体DNA的制备

1、3 沸水浴制备染色体DNA(1)在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.(3)迅速放置于常温下15 000rpm离心10分钟.(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),上清待用.4 大肠杆菌中染色体DNA的抽提(1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养45小时后,培养物以50ml/管离心收获(8 000 rpm,5min,4).(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37保温30分钟.(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37保温30分钟澄清即可.(4)取出后加

2、入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml,60保温1小时.(染色体DNA结合蛋白的消化)(5)取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M,混匀后冰浴30分钟(溶液要混合成为均相,并且冰浴要充分,时间可适当延长).(6)取出后4,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样品管要进行平衡,以免离心机受损)(7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混匀,室温下12,000rpm离心30分钟.(8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟.(9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置30分钟,15 000rpm离心30分钟.(10)75% 冰

3、乙醇洗涤5分钟.(11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA,在37水浴中放置30分钟.(12)用22.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积).(13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于-20.大肠杆菌 细菌染色体DNA 的抽提细菌, 染色体, DNA, 抽提, 大肠杆菌一、 目的熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法二、原理要进行重组DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要，抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种，这里所介绍的两种方法：一适用于

4、枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备。基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事，细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各

5、种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R10SO3 R2 蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase

6、消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌，所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的1，4 糖苷键，有助于细胞壁破裂，破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌，同时用蛋白酶K 消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质，然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。此二种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但

7、在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA 浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB 会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。三、材料（一）菌株大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151。（二）仪器电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪。（三）器皿玻璃离心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶（四）试剂（1）LB 完全肉汤培养液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。（2）BY 培养液：1%蛋白胨 0.

8、5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L TrisHCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA。（4）20%SDS（5）饱和酚（6）氯仿:异戊醇（24:1 V:V）（7）预冷无水酒精（8）TE 溶液（9）RNase溶液（10）5mol/L 醋酸钾（11）蛋白酶K 20mg/ml四、实验步骤1、取大肠杆菌C600单菌落于5 毫升LB培养液中，37振荡培养过液。2、将上述菌液1%接种量接种于20 毫升LB 培养液中，37摇床振荡培养过夜。3、已培养好的菌液，收集于10毫升的离心管中，在低速离心机上4000r/min离心10分钟，去上清，留沉淀菌体。4、用5 毫升的SET 溶液悬浮细胞，加入20% SDS 1毫升，37下轻摇过夜，使细胞裂解。5、加入等体积的饱和酚，上下轻轻摇匀，放置5 分钟后，在低速离心机上3500r/min离心10 分钟。6、取上相，加入1/2 体积的饱和酚，1/2体积的氯仿异:戊醇，上下翻转均匀，3500r/min离心10 分钟。7、取上相，加入等体积的