己烯雌酚印迹分子聚合物合成及其在残留分析中的应用

1、研究简报己烯雌酚印迹分子聚合物合成及其在残留分析中的应用马金余1陈波31姚守拙1刘程21(湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室,长沙4100812(湖南纽尔科技有限公司,长沙410007摘要以己烯雌酚(D iethylstilbestr ol,DES 为模板分子,2甲基丙烯酸为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,合成己烯雌酚分子印迹聚合物;以该聚合物为填料制成固相萃取小柱,应用于己烯雌酚残留分析的样品前处理,并比较了该固相萃取小柱与C 18固相萃取小柱对DES 保留行为的差异。通过选择不同浓度的甲醇水溶液,己烯雌酚达到理想的分离纯化效果;对加标鸡肉样进行了含量测定,回收

2、率可达95%以上。关键词分子印迹聚合物,固相萃取,己烯雌酚2004211222收稿;2005204204接受本文系国家“十五”重大科技专项“食品安全关键技术”基金资助项目(No .2001BA804A391引言固相萃取(s olid 2phase extracti on,SPE 是20世纪70年代中期出现的一种前处理技术1。该技术将分离与富集相结合,具有操作简单、负载量大、回收率高等优点,因而受到广泛应用。但是常规固相萃取填料对目标物质的富集作用缺乏选择性。分子印迹聚合物(molecular i m p rinted poly mers,M I Ps (如图1所示是一种具有固定孔穴大小、形状及

3、确定排列的功能基团的交联聚合物。它对模板分子的立体结构具有选择性“记忆”功能,可作为分子受体来模拟生物大分子行为,因此被广泛应用于识别富集和分析26。己烯雌酚(D iethylstilbestr ol,DES 化学名为(E 24,42(1,22二乙基21,22亚乙烯基双苯酚(如图1所示,是一种作用较强的人工合成雌激素。它能促进蛋白质的合成代谢,提高动物日增重和饲料使用效率。己烯雌酚能引发癌症,而且通过体内沉积能够影响胚胎发育,危害下一代。所以对动物性食品中己烯雌酚的残留检测已引起了国内外的高度重视79 。图1己烯雌酚分子印迹过程的示意图Fig .1Schematic diagra m of m

4、olecularly i m p rinting p r odureA.己烯雌酚(diethylstilbestr ol,DES 。本实验将分子印迹技术与固相萃取技术相结合,制备DES 分子印迹聚合物(DES 2M I Ps 作为固相萃取填料,应用于DES 的残留分析,取得较好的结果。2实验部分2.1仪器与试剂Shi m adzu 10A LC 2class VP 系统(日本岛津公司,含LC 210ADVP 泵、SP D 210AVP 紫外检测器、SI L 2第33卷2005年10月分析化学(FE NX I HUAXUE 研究简报Chinese Journal of Analytical Ch

5、e m istry 第10期1413141610ADVP 自动进样器、CT010AVP 柱温箱;JCX 2250W 型超声波清洗器(山东济宁超声电子仪器厂;SHB 2型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司;GSY 2型不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医疗仪器厂;Z B 282B 型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂;G L 220B 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂。己烯雌酚(99%,中国药品生物制品检定所;甲醇色谱纯,双酚A 、酚酞分析纯、甲基丙烯酸化学纯、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈均为化学纯,双蒸去离子水。2.2色谱条件色谱柱为Shi m adzu C 18(5m ,150mm 

6、15;4.6mm i .d .日本岛津公司;流动相为甲醇/水(7030,V /V ,流速1.0mL /m in;柱温30;检测波长254nm 。2.3实验方法3结果与讨论3.1定量标准曲线按所配制的标准溶液系列浓度进行液相色谱测定。以己烯雌酚的色谱峰面积(Y 和浓度(C :mg/L 做线性回归,得到的线性方程为Y =8.965C -0.354,在0.0520.0mg/L 浓度范围内呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.9996。3.2比较C 18与D ES 2M I Ps 固相萃取小柱对D ES 保留行为取4.0、6.0mg/L 己烯雌酚标准溶液各10mL 分别平行过C 18固相萃取小柱和DE

7、S 2M I Ps 固相萃取小柱(上样量分别为40.0、60.0g ,依次用20mL 30%、40%、50%和60%甲醇水溶液洗脱,洗脱液分别进HP LC 测定。由表1可知,对过C 18萃取小柱的洗脱液进行分析发现:40%的甲醇水溶液能够洗脱出少量DES;继续用50%的甲醇水溶液能够洗脱出大部分的DES;再用60%的甲醇水溶液时,仍有少量残余的DES 被洗脱。用浓度为40%、50%及60%的甲醇水溶液依次清洗DES 2M I Ps 固相萃取小柱,洗脱液中未能检测到DES;当用浓度为70%甲醇水溶液清洗DES 2M I Ps 固相萃取小柱,能有效地洗脱出富集在小柱的DES,由此可知DES 2M

8、I Ps 固相萃取小柱对目标物DES 有较好的富集分离效果。结果见图2(a 。表1C 18与DES 2M I Ps 固相萃取小柱对DES 保留行为的差异比较Table 1The comparis on of retenti on behavi or of DES bet w een C 18and DES 2moleculary i m p rinted poly mers (M I Ps s olid 2phase extracti on cartridge柱型Style of cartridge上样量Mass of l oad (g 上样过柱液Residue s oluti on (g 不

9、同浓度的甲醇洗脱液中检测DES 量The mass of DES in the eluti on s oluti on (g 30%40%50%60%70%80%C 184141分析化学第33卷由于C18、DES2M I Ps都是疏水性吸附剂,在较低浓度的甲醇水溶液中,DES与C18、DES2M I Ps 之间有图2不同甲醇浓度洗脱液的HP LC检测谱图Fig.2Chr omat ogram of DES eluted by differentconcentrati on of methanola.DES2M I Ps小柱加载DES标样(standard s oluti on ofDES l

10、oad int o DES2M I Ps cartridge;b.DES2M I Ps小柱加载混合标样(m ixed standards s oluti on l oad int o DES2M I Ps cartridge;c.DES2M I Ps小柱加载加标鸡肉样提取液(extracti on s oluti on fr om s p iked chicken sa mp lel oad int o DES2M I Ps cartridge。1.上柱液(s oluti on byl oading; 2.过柱后的溶液(residue s oluti on;3,4,5,6,7.分别为40%、5

11、0%、60%、70%、80%甲醇洗脱液(the eluting s oluti on by aqueous s oluti on including40%,50%,60%,70%,80%methanol,res pectively,色谱条件见实验部分(HP LC conditi onsas described in the experi m ental secti on。A.酚酞(phenol phthalien,B.双酚A(bis phenol A;C.己烯雌酚(diethylstilbestr ol。很强的疏水作用,使得DES在C18、DES2M I Ps上都有很强的吸附。因此30%甲醇水

12、溶液不能洗脱DES;但随着甲醇含量由40%升到60%,逐渐破坏了DES与C18之间的疏水作用,使得DES逐步被洗脱出来;而DES2M I Ps与DES之间具有双重分子间作用力,即疏水性作用和印迹作用,由于在甲醇浓度由40%提升到60%的过程中,逐渐破坏了DES与DES2M I Ps之间的疏水作用,但不足以破坏印迹作用,故与DES2M I Ps结合的DES不能被洗脱。但当甲醇含量达到70%时,会破坏DES2M I Ps与DES之间的印迹作用。同时由于DES2M I Ps对DES印迹作用的选择性、专属性使得在此条件下DES能完全被洗脱。3.3抗干扰性实验选择与己烯雌酚结构相似且含双酚功能基团的双酚

13、A和酚酞考察DES2M I Ps小柱对DES选择性保留。结果如图2(b所示,DES2M I Ps小柱对DES具有显著的选择性保留。3.4回收率测定为验证70%甲醇水溶液作为洗脱液的可靠性以及考察DES2M I Ps柱是否能重复使用,用含40g和60g的DES标准样品溶液分别上样3次,测定其回收率。由实验可知DES2M I Ps小柱分离富集DES的回收率是97.6%和98.2%;RS D均小于1.3%,并且小柱活化后能重复使用。3.5加标肉样的测定从市场购买新鲜鸡肉500g并绞碎,称取样品3份各1510g,分别加入3个100mL的容量瓶,依次加入4mL浓度为0.3、0.5、018g/质L的己烯雌

14、酚标样,混合均匀。加甲醇96mL,超声30m in,10000r/m in离心,得上清液。取上清液30mL置于100mL容量瓶,用双蒸水定容到100mL,得工作液。鸡肉空白样品的处理除不加入己烯雌酚标样外,其余步骤相同。分别取10mL过DES2M I Ps固相萃取小柱,然后依次用20mL含甲醇40%、50%、60%、70%及80%的水溶液洗脱,洗脱液中DES通过HP LC测定。结果如图2(c所示,运用DES2M I Ps固相萃取小柱能较好地排除提取液中杂质的干扰。由表2可知,DES2M I Ps小柱分离富集提取液中DES的回收率大于95%;RS D 小于210%,同时可知甲醇提取肉样中的DES

15、的回收率在98.7%99.6%之间。结果表明,DES2M I Ps 固相萃取技术是DES残留分析的实用的前处理方法。表2回收率及精密度(n=3Table2Recoveries and p recisi on(n=3鸡样Chicken samp le 加入量Added(mg提取回收率Extracti on recovery(%上样量Loaded(g固相萃取回收率SPE Recovery(%相对标准偏差RS D(%空白B lank未检出(not detected加标References1Zhang Haixia(张海霞,Zhu Pengling(朱彭龄.Chinese J.A nal.Che m.

16、(分析化学,2000,28(9:117211805141第10期马金余等:己烯雌酚印迹分子聚合物合成及其在残留分析中的应用6141分析化学第33卷2J iang Zhongyi(姜忠义.Che m istry W orld(化学世界,2003,(2:1051083Shi Ruixue(史瑞雪,Guo Chenghai(郭成海,Zou Xiaohong(邹小红,Zhu Chunye(朱春野,Zuo Yanjun(左言军, Deng Yundu(邓云度.Progress in Che m istry(化学进展,2002,14(3:1821917Pan Zuting(潘祖亭,Yao L ifeng(

17、姚礼峰,M a Hongyan(马红燕.Journal of W uhan U niversity(N atural Science Edition (武汉大学学报(自然科学版,1997,43(6:701705Syn thesis of D i ethylstilbestrol2ba sed M olecul arly I m pr i n tedPoly m ers and Its Appli ca ti on i n Resi dues Ana lysisMa J inyu1,Chen Bo31,Yao Shouzhuo1,L iu Cheng21(Key L aboratory of C

18、he m ical B iology T raditional Chinese M edicine R esearch,M inistry of Education,Hunan N or m al U niversity,Changsha4100812(Hunan N iuer Technology Co.,L TD Changsha410007AbstractU sing diethylstilbestr ol(DESas te mp late molecule,2methacrylic acid(MAAas functi onal monomer,and ethylene di m eth

19、acrylate(E DMAas cr osslinking agent,a poly mer was synthesized by molecu2 lar i m p rinting technique.The molecularly i m p rinted poly mers(M I Pswere l oaded int o the s olid2phase extracti on(SPEcartridge,which was app lied t o the p retreat m ent of residues analysis of diethylstilbestr ol. Eluti on conditi ons of DES on the s olid2phase extracti on cartridge were op ti m ized.Further more,the difference of the retenti on characteristics of diethylstilb