N-甲基亚硝基脲的制备及其诱发膀胱肿瘤的作用

1、N-甲基亚硝基脲的制备及其诱发膀胱肿瘤的作用【摘要】目的研究N-甲基亚硝基脲(MNU)制备方法及其诱发大白鼠膀胱肿瘤的作用。方法由甲胺盐酸盐合成诱癌剂MNU，进行大白鼠膀胱灌注2mg/次，每2周1次，共4次，以光镜、扫描电镜、透射电镜等为观察手段，对其诱发的膀胱肿瘤进行观察。结果8周诱发膀胱肿瘤率为100%，其组织学检查及病理学特征与人膀胱肿瘤十分相似。结论自制的MNU诱发大白鼠膀胱肿瘤为比较理想的动物模型.【关键词】化学致癌剂；N-甲基亚硝基脲；疾病模型,动物；膀胱肿瘤 Synthesis of N-methyl-N-nitrosourea(MNU)and development of ex

2、perimental model of bladder tumors induced by MNU in ratsLIU Hongyao,LI Xiaodong,MI Zhengguo,et al.(Department of Urology,First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)【Abstract】 Objective To study preparation of N-methyl-N-nitrosourea(MNU)and development of the experim

3、ental animal model of bladder trmors induced by MNU in rats. Methods Bkadder tumors were induced in femal wistar rats by intravascular administration of the carcinogen,MNU that was synthesized with CH3NH2HCL.The morphological alterations in bladded epithelial cells were studied under light microscop

4、y,scanning and transmission electron microscopy. Results The administration way of a total dose of 8 mg on 4 fraction of 2 mg at 2-weekly intrvals produced a 100 % incidence of bladder tumor after 8 weeks. Histopathological characteristics of bladder tumor induced by MNU were basically similar to th

5、ose of human bladder tumor. Conclusion Intravascular administration of MNU in rats provided a useful model for experimental studies on bladder tumor.【Key words】 Carcinogen; N-mmethyl-noitrosourea; Diseases model, animal; Bladder tumor 膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤，人们一直努力用化学物质建立一种较理想的膀胱肿瘤动物模型。我们应用自制的N-甲基亚硝基脲(MNU)成

6、功诱发了大白鼠膀胱肿瘤动物模型，现报道如下。 材料与方法1.MNU的制备：(1)制备原理：CH3NH2 HCl+NH2CONH2CH3NHCONH2+NH4CL；CH3NHCONH2+HNO2CH3NCONH2+H2ONO(2)制备步骤：在200g体积分数为24%甲胺水溶液中加入浓盐酸和300g尿素，将溶液煮沸并回流，冷至室温，在其中溶解110g亚硝酸钠，冷至0。在3L烧杯中装600g冰和100g浓硫酸的混合物，加入上述甲基尿素和亚硝酸钠混合液使溶液温度不超过0。MNU成结晶泡沫固体，浮在液面上，滤过，放置真空干燥。2.实验动物及分组：选用67周龄Wistar雌性大白鼠40只。将其随机分为2组

7、。A组(诱癌组，30只)MNU膀胱灌注2mg/次。每2周1次，共4次；B组(对照组，10只)不做特殊处理。3.实验方法：(1)MNU溶液的配制：以pH=6.0的枸橼酸缓冲液为溶剂，配成浓度为20g/L。(2)MNU膀胱灌注法：常规麻醉、消毒、导尿后，膀胱灌注。(3)标本采集：于第1次灌注MNU后第8周将所有大白鼠处死，完整切除膀胱，观察大体变化，在病变明显处取材，送光镜及电镜观察。另随机取各组5只大白鼠的其他脏器及髂内、髂外淋巴结行组织学检查。4.统计学处理：采用2检验。结果1.一般观察：所有灌注MNU的大白鼠，于麻醉后2.02.5h排尿，46h恢复活动。仅A组1只导尿后，尿道外口溢血，3d后

8、消失。所有动物处死前体重、活动无明显差别。2.病理学观察：(1)肉眼大体观察：B组所有大白鼠膀胱壁粘膜光滑，粉红色，有光泽。A组所有30只大白鼠膀胱均见肿物，16只呈菜花状，局部为褐色，8只局部粘膜隆起呈结节状，边界不清，质硬，6只为米粒状乳头状肿物，局部粘膜增厚。(2)光镜结果：B组所有大白鼠膀胱粘膜上皮由23层移行上皮细胞组成，细胞扁平大小一致，排列有序，核浆比例146。A组移行上皮癌级6只，级14只，级4只，其中Ta 5只，T110只，T210只，T3 5只。除A组3只大白鼠输尿管下端局部增厚，病理为增生及1只大白鼠左肾积水，其余各组其他脏器未见异常，淋巴结未见转移灶。3.电镜观察：(1

9、)扫描电镜：B组细胞为六角形，排列整齐，大小一致，细胞表面见细胞微嵴，高倍镜下细胞微嵴排列整齐一致，如手风琴样褶皱。A组细胞排列紊乱，大小不一，微绒毛呈多形性，以球状突起为主，末端膨大，微绒毛丰富；(2)透射电镜：B组表层细胞为扁平状，呈多角体，细胞核位于底部，胞质内有许多梭形囊泡，可连接复合体。A组细胞大，核浆比例大，核膜部分消失，可见中心粒，分裂末期核内有核小体，细胞核畸形，胞浆内有张力原纤维斜向依附桥粒两侧，多核仁，有边集现象。讨论1.MNU剂量与诱癌率及诱癌时间的关系：我们采用自制MNU多次膀胱灌注法，其癌发率为100%，与正常对照组B组相比差异有显著性(P0.01)。与Hicks1的

10、研究相比诱癌率相同，但时间短。Serers等2报道了少量多次MNU灌入膀胱，其肿瘤发生率较大量少次灌入的显著增高。Irving等3研究表明，MNU分次灌入膀胱内其诱癌率与MNU总 量或灌入次数呈正相关，且诱癌需时与MNU总剂量呈负相关，本实验MNU每次2mg无动物死亡，总量8mg较Hicks1研究中6mg量大，诱癌需时较Hicks1研究的短，适用于短期诱癌。2.MNU膀胱灌注法：MNU分子式CH3N(NO)CONH2自发分解与溶液pH值有关2，pH=6.0时其半衰期为300min，pH=7.0时为72min。我们在本实验中采用pH=6.0缓冲液为溶剂，其半衰期较Hicks1采用的pH=7.0的

11、缓冲液相对长，确保MNU在膀胱内的作用时间，增强了MNU的诱癌作用。我们采用麻醉后导尿灌入，95%的大白鼠于麻醉后2.02.5h方排尿，满足MNU在膀胱内保留2h，排除了Serers等2及Hicks1研究中灌入后钳夹尿道可能造成的损伤。3.MNU诱癌的特异性及人膀胱肿瘤性质比较：本实验诱癌组结果表明，除膀胱外其他脏器未见肿瘤发生，仅3只输尿管下端局部增厚(1只管腔狭窄致肾积水)，病理检查均为增生，考虑与返流有关，与Hicks1及Serers等2的结果一致，证明MNU膀胱灌注具有膀胱特异性。我们在本实验中诱导的膀胱肿瘤组织学形态及病理特征与人膀胱肿瘤十分相似，都来自粘膜上皮，其中移行上皮癌占80

12、%，较人类膀胱肿瘤中移行上皮癌(90%)低，与国外相同，20%为鳞癌及鳞癌与移行细胞混合较人类高(6%7%)，考虑与MNU局部刺激使细胞鳞状化生有关。本实验诱癌组未见腺瘤，人类膀胱癌中腺癌最少，仅占1%2%。总之，我们以自制MNU经尿道膀胱灌注诱发大白鼠膀胱肿瘤模型，符合Mc Cormick等4提出的理想肿瘤模型应具备的条件。基金项目：山西省自然科学基金资助项目(971024)作者单位：刘红耀(山西医科大学第一医院泌尿外科 太原，030001)米振国(山西医科大学第一医院泌尿外科 太原，030001)王东文(山西医科大学第一医院泌尿外科 太原，030001)佟锦(山西医科大学第一医院泌尿外科

13、太原，030001)李晓东(太原理工大学化工系)李春华(山西医科大学中心实验室)李柄太(电镜室)参考文献1，Hicks RM. Multistage cacinogenesis in the urinary bladder. Br Med Bull, 1980, 36:39-46.2，Serers NJ, Barnes SH, Wright R, et al. Induction of bladder cancer in rats by fractionated intravesicular doses of N-methyl-N-nitrosourea. Br J Cancer, 1982,45:337-350.3，Irving CC, Cox R, Murphy WM, et al. Influence of dose of N-nitrosourea on the induction of urinary bladder cancer in rats. Cancer Letter， 1979,8:3-7.4，Mc Corm