亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原

1、亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原甘宏宇 商振华 秦国平 刘学良 3 王俊德(中国科学院大连化学物理研究所 , 大连 116012摘 要 首次以尼龙膜为基质 , 分别采用三氯三嗪和 1,42丁二醇二缩水甘油醚活化法 , 制备了以 L 2赖氨酸为配基的亲和膜 。 首次使用亲和膜色谱法成功地从人血浆中快速纯化出了高纯度的纤溶酶原 , 电泳分析显示一个主要的谱带 。 为规模化快速纯化临床用高纯度纤溶酶原提供了新方法 。关键词 亲和膜色谱 , 人血浆 , 纤溶酶原 , 纯化 2000209207收稿 ;2000212219接受本文系国家自然科学基金资助项目 (N o. 200750311 引 言纤溶酶原

2、(plasminogen 为糖蛋白 , 分子量是 8100085000 13 , 在正常人血浆中含量约 100200mg L 4 。 纤溶酶原活化后可转变成具有活性的血纤维蛋白溶酶 , 能溶解血液的血纤维蛋白凝块 (fibrin clots 4 , 因此纤溶酶原是制备溶血栓药物的主要原料 5 。 纤溶酶原的纯化和测定对其临床研究及溶栓 疗法的监控具有重要意义 6,7。Deutsch 和 Mertz1970年首先报道了利用 L 2赖氨酸为配体 , 从人血浆中纯化纤溶酶原的结果 , 纯化倍数为 250, 活性为 10CT A 单位吸光度 (尿激酶法测定 3 。 目前国内外纯化纤溶酶原一般采用 Se

3、pharose 24B 介质 。 膜亲和法具有快速 、 收率高的特点 , 因此本实验选用价廉易得的平板尼龙膜为介质 , 分别采用 三氯三嗪 (CyCl 3 、 1,42丁二醇二缩水甘油醚 (BDE 活化法 , 偶联 L 2赖氨酸配基制备亲和膜 , 首次用膜亲 和法从人血浆中纯化出纤溶酶原 。 2 实验部分2. 1 仪器与材料Automated Econo System 蛋白质制备仪 (美国 Bio 2Rad 公司 。尼龙 6平板膜 (江西庆江化工厂 , 人纤溶酶原标样 (69U mg 蛋白 ,Sigma 公司 , L 2赖氨酸 (Lys , 层 析纯 , 上海康达氨基酸厂 ,62氨基己酸 (9

4、9%,ACROS , 人血浆 (大连市中心血站 , 低分子量标准蛋白 (磷酸化酶 B , 牛血清白蛋白 (BS A , 肌动蛋白 , 碳酸酐酶 , 烟草花叶病毒外壳蛋白 为中科院上海生化所 东风生化试剂厂产品 ; 其余试剂均为国产分析纯 。亲和纯化缓冲液 :上样缓冲液 (平衡缓冲液 :0.1m ol L pH 7. 4磷酸盐 23mm ol L E DT A 缓冲液 ; 洗涤 液 :0.3m ol L pH 7. 4磷酸盐 23mm ol L E DT A 缓冲液 ; 洗脱液 :0. 2m ol L 62氨基己酸溶于上样缓冲液中 ; 再生液 :上样缓冲液中加入 4m ol L 的脲 。 所有血

5、浆样品均用上样缓冲液稀释 , 并用滤纸预过滤 , 所有盐溶液均用二次蒸馏水配制并用 0. 45m 水膜过滤 。 2. 2 亲和介质的合成2. 2. 1 CyCl 3法 (编号为 NCH L1 将 CyCl 3活化的并键合了己二胺的羟乙基纤维素 (HEC 改性尼龙 膜 8,9 浸入用碳酸盐调 pH 至 910的 Lys 中 ,45 下反应过夜 , 用茚三酮法测得配基数为 35. 34mg g 膜 。 将膜水洗后浸入 1m ol L 巯基乙醇中 (pH 7. 0 ,45 下反应 4h 后室温放置过夜 。 大量水洗 、 干燥 。2. 2. 2 1,42丁二醇二缩水甘油醚法 (编号为 NBH L 2

6、参考 E. K lein 及 Beeskow 等的工作制备含 HEC 的尼龙膜 1012 。 膜经 BDE 活化后浸入用 0. 5m ol L Na 2C O 3溶解的 Lys 中 , 于 75 下反应 5h , 室温放置 过夜 , 用大量水抽洗 。 以茚三酮法测得配基密度约为 84. 2mg g 膜 , 最后用 0. 2m ol L 乙醇胺封闭 24h 。 第 29卷2001年 8月 分析化学 (FE NXI H UAX UE 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 8期 8948972. 3 人血浆纤溶酶原的亲和纯化步骤分别将直径 47

7、mm 的亲和膜片组装成膜堆 , 在蛋白质制备仪上进行亲和纯化 。 用上样缓冲液平衡 膜堆后将血浆样品上样 , 以洗涤缓冲液洗涤至基线平稳 , 然后用洗脱液洗脱 , 再生液再生 , 最后以平衡缓 冲液平衡膜堆 。 分别收集洗脱液和再生液 , 测定 280nm 的光密度 (A 280 , 以 BS A 为标准计算脱附量 。 将洗脱组分对 0. 0625m ol L pH 6. 8缓冲液透析 , 做聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 (S DS 2PAGE 进行分析 。 3 结果与讨论3. 1 人血浆中纤溶酶原的纯化结果图 1为 NCH L1和 NBH L2亲和膜堆对人血浆纤溶酶原的纯化谱图 , 数据见表 1。

8、 由图 1可见 ,NBH L2的洗脱峰面积大 , 再生洗脱峰面积小 , 二者峰面积之比是 0. 94 1, 而 NCH L1的二者峰面积之比仅为 0. 19 1。 由表 1可见 ,NBH L2的配基密度是 NCH L1的 2倍 。 这是因为 Lys 是亲水性的氨基酸 , 与含有亲 水性间隔臂的 BDE 之间作用力更强 , 因而键合配基数多 , 纯化效果好 。由此可见活化方法与所键合的 配基类型密切相关 。图 1 NCH L1(a 和 NBH L2(b 亲和纯化人血浆纤溶酶原Fig. 1 A ffinity purification of plasminogen on NCH L1(a and

9、NBH L2(b membrane stack10×<47mm 膜堆 (stack ; 样品 (sam ple :2.5m L 人血浆用平衡缓冲液稀释至 10m L (2. 5m L human plasmadiluted to 10ml with equilibration bu ffer ; A 280, ATT =7; 流速 (flow rate :1m L min 。表 1 NCH L1和 NBH L2亲和膜堆纯化纤溶酶原的结果T able 1 Purification results for plasminogen on NCH L1and NBH L2affinit

10、y membrane stack亲和膜A ffinity membrane配基密度 Ligand density (mg g 62氨基己酸洗脱峰面积 Area of the main peak eluted with 62aminocaproic acid (mm 2 脲洗脱峰面积 Area of peak eluted with urea (mm 2 两峰比例 Ratio of tw o peaks NCP L135. 31869860. 19 1NBH L284. 22802960. 94 1两种膜的洗脱峰均有两个峰 ,NBH L2膜洗脱时小峰与主峰之间可达到基线分离 , 而 NCH L1

11、膜洗脱 时不能达到基线分离 。 图 2为 62氨基己酸洗脱峰和脲洗脱峰的电泳分析 , 以低分子量标准蛋白为标准 , 确定电泳条带的分子量 , 分子量对数与迁移距离的关系见图 3。根据图 2的电泳分析谱带的深浅可证 实洗脱峰中峰面积大的峰为纤溶酶原 。 由于 62氨基己酸是纤溶酶原的特异性抑制剂 , 洗脱为特异性洗 脱 , 因此主峰前的小峰可能为纤溶酶原在纯化过程中的降解产物 13 。 因 NCH L1中的疏水性间隔臂可能 与纤溶酶原的降解产物之间存在疏水相互作用而不能达到基线分离 。由图 2的电泳结果可见 ,NCH L1的 62氨基己酸洗脱峰只有一个单一的纤溶酶原谱带 , 分子量约为 8500

12、0, 少于纤溶酶原标样的 4个谱带 , 说明纯化的人血浆纤溶酶原的纯度比纤溶酶原标样 (Sigma 高 。张永钟等纯化的纤溶酶原电泳也获得一个谱带 14 ,Deutsch 等获得的是 8到 9个谱带 3 。脲洗脱峰中有 3号和 4号二个谱带 , 分子量分别为 60000和 55000, 与纤溶酶原标样中相同位置的谱带对应 。 上述结果表明采用 NCH L1膜亲和法可以从人 血浆中得到高纯度的纤溶酶原 。598第 8期 甘宏宇等 :亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原 图 2 亲和纯化纤溶酶原洗脱峰 S DS 2PAGE 电泳分析Fig. 2 S odium dodecylsulphate polya

13、crylamide gel (S DS 2PAGE electrophoresis analysis of plasminogen purified1. 标准蛋白 (standard proteins ;2. 62氨基己酸从 NBH L2膜堆上洗脱下的组分 (fraction eluted by 62aminocaproic acid on NBH L2stack ; 3.62氨基己酸从 NCH L1膜堆上洗脱下的组分 (fraction eluted by 62aminocaproic acid on NCH L1stack ;4. 脲从 NCH L1膜堆上洗脱下的组分 (fraction

14、eluted with urea on NCH L1stack ; 5. 人 纤 溶 酶 原(human plasminogen 。 图 3 S DS 2PAGE 电泳分子量的对数与迁移距离的标准曲线 Fig. 3 S tandard curve of log (Mr 2trans fer distance on S DS 2 PAGE 图 4 NBH L2膜堆亲和纯化人血浆中的纤溶酶原 Fig. 4 A ffinity purification of plasminogen on NBH L2stack 27×<47mm 膜堆 (stack ;20m L 人血浆用平衡缓冲液稀

15、释至 40m L (20m L human plasma diluted to 40m L with equilibration bu ffer ; 上样和洗脱速 度 (feed and elution rate :1m L min ; 洗 涤 速 度 (washing rate :3m L min 。 图 2的 NBH L2的 62氨基己酸洗脱峰则有一个主要的纤溶酶原谱带和两个次要的 1号和 2号谱图 5 NBH L2膜堆亲和纯化的纤溶酶原电泳分析 Fig. 5 S DS 2PAGE analysis of plasminogen purified onNBH L2stack 1. 62氨基

16、己酸洗脱组分 (fraction eluted with 62aminocaproic acid ; 2. 脲洗脱组分 (fraction eluted with urea ;3. 人纤溶酶原 (human plasminogen 。带 , 分子量分别为 72000和 67000, 与纤溶酶原标样相比可知 ,1号和 2号谱带是杂蛋白 。该结果与金灿煌等获得的 4个谱带 5 的结果相近 。 说明 NBH L2膜的非特异性吸附高于 NCH L1膜 。3. 2 人血浆纤溶酶原的放大纯化组装 27张膜的 NBH L2膜堆 , 上样 20m L 血浆 ,从人血浆中纯化大量的纤溶酶原 。纯化谱图见图4。

17、由图可见 ,62氨基己酸洗脱峰明显裂分为 3个 峰 , 纯化量大时 , 纤溶酶原的降解产物峰变得明显 。将 62氨基己酸洗脱峰 、 脲洗脱峰及标准人纤溶酶原进行电泳 (见图 5 。 电泳图中肉眼可见 1个主要谱 带和 67个次要谱带 , 放大纯化后获得的纤溶酶原 纯度提高 。 本文用 27×<47mm NBH L2亲和膜堆可从 20m L 人血浆中纯化出纤溶酶原 0. 5mg , 纤溶酶原回收率约为 12. 5%25%。 R eferences1 Hatton M W C , Reg oeczi E. Biochimica et Biophysica Acta , 1976,

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