重症肺炎模型定量病理学研究

1、重症肺炎模型定量病理学研究        【摘要】     目的 用体视学方法定量研究SD（Sprague Dawley）大鼠细菌性重症肺炎模型病理的三维形态结构特点及变化规律。方法 SD大鼠随机分为模型组、观察组和对照组(每组分为3小组，前两组每小组8只，对照组每小组4只)。其中，模型组和观察组分别接种相同浓度不同剂量的肺炎克雷伯菌菌液，对照组接种与模型组剂量相同的生理盐水。分别于接种后的第2、4、6天分批处死动物。留取肺组织标本，HE染色，每张切片随机取34个视

2、野，用Image-Pro图像分析软件分别测试肺实质红细胞体积密度、支气管残余管腔体积密度、肺泡体积密度。结果 随着接种时间的延长，模型组、观察组的肺实质红细胞体积密度的变异系数逐渐增大，尤以模型组增大明显；模型组、观察组的支气管残余管腔体积密度变异系数逐渐减小，尤以模型组明显；模型组、观察组肺泡体积密度的变异系数逐渐变小，尤以模型组明显。对照组则无明显变化。结论 随着接种时间的延长，模型组、观察组病变逐渐加重，尤以模型组更为明显。在病理体视学上表现为：红细胞在整个肺组织中的体积增加；支气管残余管腔与原始管腔的比积减小；肺泡腔与整个肺实质体积比减小。    

3、0;【关键词】  大鼠模型；重症肺炎；肺炎克雷伯菌；体视学；定量；三维结构    A Quantitatively Pathological Study in Rat Model of Severe PneumoniaChen Yemin, Hou Tongchuan, Bo Zhengming, Shen HongMilitary Hospital No. 41, Shannan, Tibet Autonomous Region 856000ABSTRACT  Objective  To make a quantitati

4、ve study of the characteristics and the change law of the pathological 3d structure of severe bacteria pneumonia model in Sprague-Dawley (SD) rats with stereological method. Methods  The SD rats were randomly divided into 3 groups: model group, observation group and control group; rats in model

5、 group and observation group were inoculated with Klebsiella pneumonia suspension at different doses while rats in control group were inoculated with saline at the same dose of the suspension in model group; the rats in each group were scarified at each time intervals (2d, 4d and 6d after inoculatio

6、n) respectively, and the lung tissue specimens were collected and were stained with HE; 3 to 4 visual fields from each section were selected and the volume density of the erythrocyte, the alveolus and the residual lumens of bronchi in the lung parenchyma were analyzed with the Image-Pro image analys

7、is system. Results  With the time prolonged, the coefficient of variation (CoV) of volume density of the erythrocyte in the lung parenchyma in model group and observation group kept increasing, especially that in model group; the CoV of volume density of the alveolus and the residual lumens in

8、model group and observation group kept decreasing, especially that in model group; no obvious changes were found in control group.Conclusions  The pathological changes in model group and observation group will get more and more severe with the time of inoculation prolonged, especially those in

9、model group; the pathological stereological manifestations are the erythrocyte volume increase in the whole lung tissue, the volume ratio decrease of the residual lumens to the origioal lumen of the bronchi and volume ratio decrease of the alveolar space to the whole lung parenchyma.KEYWORDS  r

10、at model  severe pneumonia  Klebsiella pneumoniae   stereology  Quantitative  3-dimension structure    目前，肺炎的病理及形态定量研究主要集中在电镜、光镜等二维水平的病理结构方面。我们于2005年12月成功建立重症肺炎动物模型1，留取肺组织标本，采用体视学定量方法对重症肺炎模型病理进行三维空间的形态定量研究，从三维水平上定量认识重症肺炎模型形态结构的基本特点和变化规律。1  材料与方法1.1&#

11、160; 病原肺炎克雷伯菌临床株由我院检验科细菌室提供，分离于慢性支气管炎急性发作病人的痰液。接种前生理盐水稀释致适当浓度（相当于1.2×109CFU/ml）。1.2  动物与分组 清洁级Sprague Dawleg(SD)雄性大鼠60只，鼠龄为58个月，质量180260g。随机分为模型组、观察组和对照组，前两组每组分为3小组，每小组8只，对照组每小组4只。分别于接种后的第2、4、6天分批处死动物。其中模型组分别于接种后的第5、第6天各死亡1只，后补做。1.3  接种 动物麻醉后，颈部消毒、备皮无菌操作，暴露大鼠上段气管，用1ml注射器经气管滴

12、入菌液。其中，观察组滴入0.15ml，模型组滴入0.3ml，对照组滴入相同剂量的生理盐水。接种后立即竖立大鼠固定台，使大鼠保持直立位约20s，以保证接种菌液因重力作用而入肺。1.4  取材和标本收集 分别于接种后的第2、4、6天分批处死动物。无菌开胸取肺，肺组织以5%的福尔马林液固定、石蜡包埋，切片HE染色。1.5  分析方法和图像分析软件 病理标本HE染色，肺实质红细胞体积密度、肺泡体积密度每张切片在40倍，支气管残余管腔体积密度在10倍物镜下随机取34个视野，经Leica显微摄像系统输入计算机，用Q500MC型图像分析软件分别测试。测试前，用物镜测微

13、尺对该软件进行标定，分别测试标本的面积和周长。1.6  体视学参数的选用和计算 选用的测量参数有：支气管残余管腔的体积密度；肺泡腔的体积密度；肺实质中红细胞的体积密度。根据Q500MC型图像分析软件的测试结果，按体视学公式计算出所测得的参数2。1.7  统计学方法 计数资料所有数据采用SPSS10.0统计分析软件处理，参数用均数±标准差(±s)，表示采用单因素方差分析。2  结  果2.1  临床表现  动物接种第一天，观察组和模型组均出现烦躁、活动增强，体温升高达39.4。第2、3天动物进食、

14、活动度明显下降，毛发直竖，卷曲于饲养笼角落，尤以模型组动物明显。从第4天起，动物食欲、活动度进一步下降，模型组大鼠部分出现嗜睡（触之可醒），可闻及明显呼吸喘鸣声，最高体温达41.3，观察组最高体温达40.1，第5、第6天，观察组和模型组上诉症状进一步加重，尤以模型组动物明显，体重减轻，出现明显骨感。模型组部分大鼠颜面部、四肢出现紫绀，呼吸急促，呼吸困难。模型组于第5、6天各死亡1只（后补做）。对照组大鼠进食、活动度、体重、体温较接种前无明显变化。2.2  各组支气管残余管腔的体积密度 接种后的第2天，各组间比较无统计学意义（0.05）；随着接种时间的延长，模型组、观察组支气

15、管残余管腔的体积密度值逐渐减小，尤以模型组明显。于第4天始模型组与观察组、对照组比较具有显著统计学意义（0.05，0.01），见表1。表1  各组支气管残余管腔的体积密度（略）注：与观察组、对照组及模型组的第2天比较具有统计学意义 （0.05）；与观察组、对照组比较具有显著统计学意义（0.01）。2.3  各组肺泡腔的体积密度 接种后的第2天，各组间比较无统计学意义（0.05）；于接种的第4天，模型组肺泡腔体积密度明显减少，与观察组、对照组比较具有统计学意义（0.05，0.01），而观察组与对照组比较无统计学意义（0.05）；于接种后的第6天，观察组、模型组肺泡腔

16、体积密度进一步下降，尤以模型组下降明显，与各组比较具有显著统计学意义（0.01），而对照组则无明显变化，见表2。表2  各组肺泡腔的体积密度（略）注：与观察组、对照组及模型组的第2天比较具有统计学意义（0.05，0.01）；与观察组、对照组比较具有显著统计学意义（0.01）2.4  各组肺组织红细胞的体积密度 于接种后的第2天开始，观察组、模型组的肺组织红细胞体积密度逐渐升高，尤以模型组升高明显；从第2天开始，模型组与观察组、对照组比较均具有统计学意义（0.05）；而观察组与对照组则无统计学意义（0.05），对照组则无明显变化，见表3。表3  各组肺组织

17、红细胞的体积密度（略）注：与观察组、对照组比较具有统计学意义（0.05）3  讨  论    肺炎是威胁人类健康的重要疾病。近几十年来，重症肺炎的病死率几乎没有下降，随着耐药菌的不断增加，需要开发新的非抗生素治疗策略，这就需要我们更好地理解重症肺炎的病理生理特点3。国内外学者正在积极探索对重症肺炎新的治疗途径，如细胞因子、免疫治疗等。我们通过病理体视学检测，从三维定量的角度来认识重症肺炎模型的病理变化特点和变化规律。有利于对重症肺炎的全面认识、疾病发展的分期及预后进行判断和评估。    生物体视学是由几何学、概率学

18、、微积分、拓扑学、定量分析技术、生物组织学和图像分析技术有机结合，由二维结构信息定量推论三维结构信息的新兴边缘学科4。其中定量病理学是生物体视学应用领域的重要组成部分5。其研究范畴涉及绝大多数系统、组织、细胞及大部分的亚微结构68。而对重症肺炎的病理定量研究目前国内未见相关文献报道。本文旨在这方面作一些初步探索。    我们所选择支气管残余管腔的体积密度、肺泡腔的体积密度、肺实质中红细胞的体积密度这三个测量参数能够较为准确、客观地反映重症肺炎模型肺组织病理变化的严重程度。支气管残余管腔的体积密度是指单位体积支气管原始管腔中支气管残余管腔所占的体积。当管腔因炎症、阻

19、塞等原因致使支气管管腔受损破坏，其体积密度减小。其体积密度的变化随着支气管管腔受损程度的变化而变化，当支气管管腔炎性渗出物越多，其体积密度越小。肺泡腔的体积密度是指单位体积的肺实质中肺泡腔所占的体积。当肺实质因炎症、水肿、渗出、出血等原因，导致肺泡腔体积减小，则肺泡腔体积密度降低。其体积密度的变化随着肺实质炎性渗出的变化而变化，当肺泡腔炎性渗出越多，其体积密度越小。本文中肺泡红细胞的体积密度是指单位体积的肺实质中红细胞所占的体积。当肺组织因炎症或其他因素导致肺组织出血、充血，其体积密度增加。其病变越重，出血、充血越明显，其体积密度越大。本研究中，随着接种时间的延长，模型组的病情加重，在体视学上

20、表现为支气管残余管腔的体积密度、肺泡腔的体积密度呈进行性减小，肺泡中红细胞的体积密度则逐渐升高。模型组的病理体视学变化趋势与重症肺炎模型的血液动力学、动脉血气分析变化的趋势是一致的1。即随着接种时间的延长，接种大剂量菌液的模型组其病理改变较观察组、对照组明显加重。这从定量病理学上进一步验证我们成功建立重症肺炎动物模型。从本研究中可以看出，重症肺炎由于炎性渗出、出血多，管腔狭窄明显，致使血气分析、血液动力学发生改变。改善其通气状况可能为扭转病情发展的关键。    随着接种时间的延长，模型组大体肉眼所见肺组织为深红色，可见肺组织广泛出血，弹性差，于第6天用手触摸有实质

21、感。观察组肺组织均为淡红色，可见肺组织出血点。对照组肺组织均为淡白色，弹性良好。电镜观察可见对照组肺组织形态大致正常；观察组支气管周围、肺泡壁充血，中性粒细胞浸润，随着接种后时间的延长，上述病理改变成逐渐加重的趋势；模型组于第6天电镜下所见各级支气管周围大量白细胞、中性粒细胞浸润，同时可见肺组织广泛出血，肺泡壁广泛受到破坏。    【参考文献】  陈业民，黄文杰，李胜利等. 肺炎克雷伯菌致大鼠重症肺炎模型的建立. 第一军医大学学报，2005，25（12）：14981502.申洪，沈忠英. 实用生物体视学技术.广州：中山大学出版社. 1991.Waterer GW, Wunderink RG, Genetic susceptibility to pneumonia. Clin Chest Med 2005，26:2938.Manoonkitiwongsa P S, Mcmillan P J, Schultz R L, et al. A simple stereologic meth