骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质修复关节软骨全层缺损

1、作者：冯万文，夏亚一，孙正义，吴萌，王翠芳，党跃修【关键词】骨髓间充质干细胞；软骨细胞；共同培养技术；脱钙骨基质；关节软骨修复Fullthickness articular cartilage defect repairment by coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells with chondrocytes and implantation into allogenic demineralized bone matrix in rabbits【Abstract】 AIM: To investigate

2、the feasibility of articular cartilage defect repairmentby coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs) with chondrocytetes and implantation into allogenic demineralized bone matrix(DBM), evaluate the outcomes of repairmentin order to provide a theoretical basis for optimi

3、zing cell resources for seeding. METHODS: Twopassaged BMSCs and chondrocytes were collected both at a concentration of 5109/L and then cocultured at 21. Articular cartilage defects in the knee joints of rabbits repaired by the cocultured cells seeded into allogenic DBM served as experimental group A

4、, by simple DBM as control group B and by nothing as control group C. Repaired tissues were evaluated with macroscopic observation,histological scores and immunohistochemical staining at week 8 and 16 after transplantation. RESULTS: Chondrocytes cocultured became rich in extracellular matrix and pro

5、liferated promptly. The ratio of chondrocytes to BMSCs achieved above 11 at 5-7 d after coculture.In the experimental group A repaired tissues represented hyaline,smooth and flat.Chondrocytes in the zones of integrating with peripheral native cartilages were more mature. In the control group B and C

6、, repaired tissues were fibers.Histological scores indicated that experimental group A excelled group B and C, and the differences were statistically significant(P0.05). Immunohistochemical staining showed that cells in the zones of repaired tissues were larger in size, arranged columnnedly, rich in

7、 typecollagen matrix and integrated satisfactorily with native adjacent cartilages and subchondral bones in the experimental group A at week 16 postoperatively. CONCLUSION: Coculture of autogenic BMSCs with chondrocytes can promote the proliferation of chondrocytes and the production of chondral mat

8、rix. Cocultured cells for seeding can save a number of chondrocytes, shorten cultureperiods and reduce subculture times.Cocultured cells embedded into DBM can repair articular cartilage defects effectively.【Keywords】 bone marrowderived mesenchymal stem cells; chondrocytes; coculture techniques;demin

9、eralized bone matrix; articular cartilagerepair【摘要】目的： 探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质（DBM）修复关节软骨缺损的可行性，评价修复效果，为优化种子细胞源提供依据. 方法： 取浓度为5109/L的第二代BMSCs和软骨细胞，按21比例混匀共培养作为种子细胞. DBM与共培养细胞复合植入修复为实验组（A组），单纯材料DBM组（B组）和不处理组（C组）作为实验对照组. 移植8和16 wk后经大体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损修复. 结果： 共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖快，共培养57

10、d两种细胞比例达11以上. A组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟. B组和C组的修复组织呈纤维组织. 组织学评分表明A组优于B, C两组，差异具有统计学意义（P0.05）. 免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好. 结论： 自体BMSCs与软骨细胞共培养，BMSCs能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与DBM复合后能有效修复关节软骨缺损.【关键词】 骨髓间充质干细胞；软骨细胞；共同培养技术；脱钙骨基质；关节软骨修复0引言关节软

11、骨缺损自身不能有效修复，组织工程技术为解决这一难题提供了新的思路. 但由于软骨细胞来源不足严重制约了其应用1. 以自体软骨细胞作为种子细胞，取材部位受限，软骨细胞培养增殖能力低，传代培养容易引起老化和去分化2，而成体骨髓中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）含量少，随传代次数的增多，成软骨潜能明显降低， Rubio等3研究证实BMSCs多次传代培养有致瘤倾向. 我们应用自体BMSCs和软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix, DBM）修复兔膝关节软骨全层缺损，并对修复组织进行评价

12、，为优化种子细胞源提供实验依据.1材料和方法1.1材料DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物公司）；CO2孵育箱（恒温培养箱，日本Sony公司）；胶原酶（美国Sigma公司）；相差显微镜（日本BH2型Olympus显微镜）；型胶原免疫试剂盒（武汉博士德生物公司）；青紫兰兔（卫生部兰州生物制品研究所提供）.1.2方法1.2.1BMSCs与软骨细胞共培养取本研究所实验室培养的第二代自体BMSCs，浓度为5109/L的悬浮液1 mL和相同浓度的软骨细胞悬液0.5 mL （21）混匀，用含150 mL/LFBS的DMEM培养基在37饱和湿度条件下的CO2孵育箱中进行共

13、培养，待细胞汇合至单层用2.5 g/L胰酶消化与同种异体DBM复合.1.2.2同种异体DBM的制备处死同种青紫蓝兔，取四肢骨干骺端及椎体松质骨，剔除附着的肌肉及骨膜，-80冰柜中冻存72 h，参照文献4的方法进行脱钙后，再将骨块置于乙醚和乙醇中脱脂各24 h，用无菌蒸馏水反复冲洗浸泡至中性，自然干燥后环氧乙烷消毒，4保存备用.1.2.3动物模型与实验分组36个月龄的青紫兰兔54只，体质量1.01.5 kg，雌雄不限. 取膝关节内侧弧形切口，向外翻开髌骨暴露膝关节，于股骨滑车关节面上用4 mm钻头钻孔，深度约34 mm穿透软骨下骨，有阻力感见新鲜血液溢出，造成全层关节软骨缺损模型. 将动物随机分

14、为A, B, C三个处理组，每组18只. A组于软骨缺损处植入共培养细胞DBM（细胞均为自体细胞）；B组单纯植入DBM；C组不作任何植入.1.2.4指标观察相差显微镜下观察共培养细胞的形态和增殖，并对共培养细胞爬片进行番红0染色. 每组移植术后8和16 wk分别处死9只动物，取出膝关节对修复组织分别进行大体、组织学和免疫组织化学观测. 参照文献5的评分标准，对术后8和16 wk各组动物分别进行组织学评分统计学处理：应用SPSS10.0软件包对所有数据进行统计学处理，各组间差异采用单因素方差分析，P0.05认为差异有统计学意义.2结果2.1共培养细胞形态学观察共培养细胞24 h后逐渐贴壁，软骨细

15、胞呈椭圆形或三角形，大部分居混合细胞的中央，表面光滑，细胞体积变大，胞质增多，细胞数量多增殖旺盛，细胞外基质合成丰富被番红0均匀染色;BMSCs细胞体积无明显增大，散在于共培养细胞中，表面呈成纤维细胞样染色阴性，所占比例逐渐降低. 共培养57 d，软骨细胞与BMSCs比例达11以上（图1）.图1BMSCs和软骨细胞共培养番红0染色200(蓝色箭头示软骨细胞，红色箭头示BMSCs)（略）2.2大体标本观察术后所有动物切口愈合良好，关节液清亮，关节腔无粘连、滑膜增生、关节游离体及骨赘形成. A组： 术后8 wk缺损已由半透明、淡红色组织填充，边界模糊，表面光滑；16 wk与周围软骨色泽相近，表面平

16、整（图2）. B组： 术后8 wk缺损区修复组织为乳白色，表面不光整，部分仍呈空洞；16 wk为纤维性修复. C组：术后8 wk缺损区为纤维样组织覆盖，色泽暗灰；16 wk周围软骨呈虫蚀样改变.2.3组织学观察A组： 术后8 wk修复组织细胞较多，以圆形透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形成纤维样细胞，与周围软骨结合，基底部较多新生骨形成；16 wk修复组织为透明软骨样，厚度接近正常，与周围软骨结合好，深层软骨钙化，与底层骨结合紧密，基质着色正常，未见DBM残留（图3）. B组： 术后8 wk缺损组织细胞较少，细胞层次排列差；16 wk修复组织菲薄，呈纤维样，与周围软骨未结合，基底部有少

17、量新生骨形成. C组： 术后8 wk缺损组织有薄层纤维组织覆盖；16 wk缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合.术后8和16 wk A组评分均优于B, C组（P0.05）. 图2共培养细胞DBM修复关节缺损的大体观察(箭头示修复部位)（略）图3共培养细胞DBM组修复关节缺损的组织学观察甲苯胺兰染色200(箭头示修复组织)（略）2.4免疫组织化学术后16 wk时A组修复组织中细胞呈圆形或椭圆形，形体大柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好，细胞质和细胞外间质中型胶原染色阳性，出现棕黄色颗粒（图4）；B组和C组修复组织未出现黄染的阳性区域.图4免疫组织化学染色检测共培养细胞DBM组修复组织的

18、型胶原DAB染色100(箭头示修复组织)（略）3讨论关节软骨组织代谢活性较低，创伤和手术等所致的软骨损伤或缺损难以自我修复或以纤维组织填充替代，影响关节功能的恢复. 细胞生物学和生物材料技术的发展，应用组织工程技术修复软骨缺损成为可能，但是至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求6. Tsuchiya等7用人BMSCs与牛软骨细胞按不同比例混合进行共培养，发现软骨细胞的增殖速度和细胞外基质的合成与BMSCs的比例呈正相关. 我们通过BMSCs与软骨细胞体外共培养发现，共培养的软骨细胞比单独培养的同代软骨细胞体积大，增殖速度加快，有大量成熟的软骨陷窝形成和基质合成，说明BMSCs能

19、促进软骨细胞的增殖和表型维持，因此，共培养使软骨细胞快速增殖，这就节省了软骨细胞的用量,避免了为获取足够量的软骨细胞反复传代培养而引起的软骨细胞老化和去分化2. 而BMSCs体积变化不明显或轻度缩小，并且连续培养后两种细胞的比例仍可保持在21左右，说明软骨细胞和BMSCs的增殖速度相接近，这与Tsuchiya等7的结果相似，这是否由软骨细胞将BMSCs诱导成或将分化为软骨细胞并合成细胞外基质，尚需进行深入研究.单独BMSCs在非软骨环境下并不能构建出软骨组织，而用20%以上的少量软骨细胞与BMSCs共培养可构建出成熟的工程化软骨，并且在软骨湿重、糖胺多糖含量和软骨特异性基质表达等方面都优于相同

20、数量的软骨细胞构建的软骨，比用单独软骨细胞构建软骨组织可减少60%80%的软骨细胞量,为解决软骨细胞来源不足提供了切实可行的途径8. 研究表明BMSCs和软骨细胞共培养期间TGF3, BMP2, IGF1和FGF2等生长因子表达增加5.411.6倍不等，增强的活性因子介导软骨细胞旁分泌或自分泌，可能是促进软骨细胞增殖和表型维持的主要因素之一，Goldberg等9应用含血清和TGF的培养基分别培养软骨细胞进行比较，结果也显示TGF能使去分化的软骨细胞重新分化和表型的维持，但具体的信号传导及其途径尚不清楚10-12.我们应用BMSCs和软骨细胞共培养与DBM复合移植修复关节软骨缺损，修复组织内细胞

21、形态类似于透明软骨细胞，细胞周围有软骨陷窝形成，免疫组化结果显示为型胶原纤维，证实了修复组织为透明样软骨. 共培养复合物中的BMSCs直接分化为骨细胞直接与周围的软骨下骨进行骨与骨的整合，比单独培养的软骨细胞与软骨下骨结合更加牢固，但修复组织与周围正常软骨仍有差别，主要表现为细胞数量多且排列紊乱，术后16 wk细胞数量减少并出现了柱状排列趋势，更接近于正常软骨组织，可能是术后不限制关节活动，修复组织在局部应力作用下发生改建所致13. B组软骨缺损基底部也有新骨形成，是由于载体材料的存在使髓腔或松质骨中的MSCs驻留在损伤区底部，进而分化成少量骨组织14.我们应用的同种异体DBM是经冷冻、脱脂、

22、脱钙、去蛋白处理得到的产物，抗原性消除或大大降低，且保留了诱导软骨形成的生长因子和胶原等基质，有利于细胞增殖和分化. DBM为多孔海绵样结构，可提供宽大空间容纳大量的种子细胞，利于细胞黏附、细胞外基质沉淀、营养和氧气的进入以及代谢产物的排出. DBM植入缺损部位后第四周开始吸收，完全吸收需812 wk，而软骨形成需68 wk，因此DBM吸收和软骨形成几乎同步. 根据修复部位的不同可调整脱钙时间，或部分脱钙和表面脱钙，能适应不同部位的生物力学强度要求. 按修复缺损的形状可剪成不同的形状和大小，应用方便. 同种异体DBM制备方法相对简便可大量获取，低温下可长期保存建立DBM骨库备用. 因此，DBM

23、是一种理想的软骨组织工程支架材料4，15.BMSCs和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，作为种子细胞可减少软骨细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，与DMB复合能有效修复关节软骨缺损，为优化种子细胞源提供了实验依据，但是共培养的两种细胞间相互作用的机制及其调节机制尚不清楚，并且本实验的动物模型是在正常关节面上造成缺损区进行的修复，有别于临床上常见的大面积不规则缺损，因此对这些问题需要进一步研究和改进.【参考文献】1 刘松波，胡蕴玉，徐虎，等. 柱形藻酸钙载体复合细胞修复异体兔膝关节软骨缺损J. 第四军医大学学报，2001,22 (11):1010-1013.2 Marlovits S,

24、 Hombauer M, Truppe M, et al. Changes in the ratio of typeand typecollagen expression during momolayer culture of human chondrocytesJ. J Bone Joint Surg(Br), 2004,86（5）:286-295.3 Rubio D, GarciaCastro J, Martin MC, et al. Spontaneous human adult stem cell transformationJ. Cancer Res, 2005,65（6）:3035

25、-3039.4 李强，孙正义，王栓科，等. 骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验J. 第四军医大学学报，2004,25（15）:1375-1378.5 Pineda S, Pollack A, Stevenson S, et al. A semiquantitative scale for histologic grading of articular cartilage repairJ. Acta Anat (Basel), 1992,143（3）:335-340.6 Vats A, Tolley NS, Polak JM. The stem cell in orth

26、opaedics surgeryJ. J Bone Joint Surg(Br), 2004,86（2）:159-163.7 Tsuchiya K, Chen G, Ushida T, et al. The effect of coculture of chondrocytes with mesenchymal stem cells on their cartilaginous phenotype in vitroJ. Mater Sci Eng, 2004,24:391-396.8 周广东，苗春雷，王晓云，等. 软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究J. 中华医学杂志，2004,

27、84（20）:1716-1720.9 Goldberg AJ, Lee DA, Bader DL, et al. Autologous chondrocytes implantation: Culture in a TGFcontaining medium enhances the reexpression of a chondrocytic phenotype in passaged human chondrocytes in pellet cultureJ. J Bone Joint Surg(Br), 2005,87（1）:128-134.10 Jakob M, Demarteau O, Schafer D,et al. Specific growth factors during the expansion and redifferentiation of adult human articular chondrocytes enhance chondrogenesis and cartilaginous tissue formation in vitroJ. J Cell Bioc