肝癌细胞铁蛋白磁共振成像的实验研究

1、肝癌细胞铁蛋白磁共振成像的实验研究        【摘要】     目的 研究肝癌细胞中内源性铁蛋白的表达情况，并进一步分析铁蛋白的表达与磁共振成像（MRI）的信号关系如何。方法 对3种肝癌细胞株QGY-7703、HepG2、SK-Hep-1以及正常肝细胞 L02，4种细胞株内源性铁蛋白表达情况进行检测，用RT-PCR方法检测基因表达，Western blot检测细胞株中铁蛋白表达，同时测定细胞培养液上清中铁蛋白的分泌量。最后检测4种细胞磁共振信号的情况，分析细胞铁

2、蛋白表达与磁共振信号的关系。结果 RT-PCR与Western Blot均显示铁蛋白的基因表达与蛋白表达，HepG2与QGY-7703表达最强， SK-Hep-1表达中等，L02表达很弱。4种细胞培养液上清中HepG2与QGY-7703分泌铁蛋白量较高，SK-Hep-1分泌较低，L02分泌量很低。磁共振细胞显像，T1WI、T2WI及PD均显示HepG2与QGY-7703磁共振信号强度低，而SK-Hep-1与L02信号强度较高。结论 各种肝癌细胞中铁蛋白表达水平不同，铁蛋白表达水平与磁共振细胞显像信号强度呈负相关。     【关键词】  铁蛋白；

3、磁共振成像；肝癌细胞        Experiment Study on MR Imaging via Ferritin in Hepatocarcinoma Cells    Abstract Purpose  To investigate the expression of endogenous ferritin in hepatocarcinoma cells. And to analyse the relation between ferritin expression an

4、d magnetic resonance imaging signals. Materials and methods  To detect the endogenous ferritin gene expression through RT-PCR and protein expression through western blot in 3 hepatocarcinoma cell lines of SK-Hep1、HepG2 and QGY-7703, and normal human hepatocyte L02 cell lines. And the supernatan

5、t of cell culture media were collected to detect ferritin secretory. The cells underwent MR imaging with T1WI、T2WI and PD to analyse the relation between ferritin expression MR signals. Results  RT-PCR and Western blotting showed the ferritin gene and protein expression of the 4 kinds of cells:

6、 HepG2 and QGY-7703 were the strongger, SK-Hep1 lower，L02 was the lowest. Four kinds of the supernatant of cell culture media showed the ferritin secretory: HepG2 and QGY-7703 were higher, SK-Hep1 lower，L02 was the lowest. Four cells were scanned by MR, and HepG2 and QGY-7703 appeared as low signal

7、intensities on T1WI、T2WI and PD, and SK-Hep1 and L02 as high signals. Conclusion  The expression of ferritin may be different in various hepatocarcinoma cells. Ferritin expression level may be negatively related to the MR imaging signal intensity.    Key words  Ferritin;

8、0; MRI;  Hepatocarcinoma cells    利用磁共振（MRI）技术进行细胞及分子水平的成像，来探索疾病的机制、诊断疾病或对疾病治疗进行监测是目前分子影像学研究的热点。分子影像学的关键在于报告系统的选择。以往研究较多的有-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和转铁蛋白受体系统1-4。而一种较为新颖的报告系统铁蛋白系统，正逐渐进入研究者的视野。铁蛋白（Ferritin，FT）是机体内铁贮存的主要形式。铁进入体内后通过转铁蛋白转铁蛋白受体系统将铁吞饮入细胞内，形成铁蛋白贮存起来，从而调节体液中自由铁的水平，提供可利用铁并阻止铁的沉积5-7。铁蛋白含量

9、的不同可以引起细胞中MRI信号的变化。铁蛋白分子结构包含中心的氧化铁晶体，和周围的蛋白骨架，这样的结构使细胞内具有高磁化率，而细胞外具有低磁化率。当各种因素导致铁蛋白量发生变化，就形成MRI的T1、T2信号变化，可以为MRI所检测8,9。Cohen等10研究将铁蛋白基因转染胶质瘤细胞，观察到MRI信号的变化。由于很多肿瘤细胞铁蛋白合成和分泌增多，铁蛋白作为肿瘤血液学检测的一种重要指标，已受到关注。但肿瘤细胞本身铁蛋白基因表达及蛋白含量如何，对MRI信号的影响又如何，这对铁蛋白系统作为MRI报告系统的应用关系密切。本研究对多种肝癌细胞的内源性铁蛋白表达情况进行检测，探索其MRI信号变化的情况，为

10、铁蛋白作为一种新颖的MRI分子影像报告系统，提供更多信息。    材料与方法    一、 试剂与仪器    正常人肝细胞L02、肝癌细胞HepG2、QGY-7703、SK-Hep1，4种细胞株均购自南京凯基生物科技发展有限公司。RPMI 1640、DMEM培养基、胎牛血清为GIBCO BRL公司产品， RNA提取试剂盒、逆转录酶为Roche公司产品，PCR反应相关试剂为Takara公司产品，铁蛋白抗体、辣根过氧化物酶联兔抗小鼠二抗及ECL 显色试剂盒为Santa Cruz 公司产品。PCR扩增引物为大连宝

11、生物工程有限公司合成。Western blot相关试剂为南京凯基生物科技发展有限公司产品。成像设备采用Philip公司，Eclipse型1.5T的MRI机。    二、 实验方法    1、细胞培养：L02、QGY-7703细胞用含10%胎牛血清的1640培养液（含青霉素100u/ml，链霉素100u/ml），HepG2、SK-Hep1用含10%胎牛血清的DMEM培养液，37、5%CO2条件下培养。    2、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：将上述4种细胞进行培养，待细胞长满培养瓶底后，0.25%胰

12、酶消化，收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，按RNA分离试剂盒的步骤，抽提细胞总RNA。提取的RNA，再加入寡聚核苷酸（Oligo dT）、dNTP、DTT、DEPC水等反应体系，用适量的逆转录酶，反应条件为42，50min，逆转录后形成cDNA。以2-MG作为内参进行RT-PCR反应，调平各细胞株mRNA量（反应引物：2-MG上游引物为5- ATG TCT CGC TCC GTG GCC TTAG，下游引物为5- GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC，条带大小为359bp）。根据Genbank FT的cDNA序列，我们设计RT-PCR引物：上游引物为5- AGA CGT

13、 TCT TCG CCG AGA GTC GTC -3，下游引物为5- AAT GCA CAC TCC ATT GCA TTC AGC -3。该引物可得到520bp的FT目的基因片段。反应条件为94预变性5min，94变性1min，50退火1min，72延伸1min，31循环，72延迟10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，比较各细胞株内源性FT表达的情况，并对目的条带用Lab Work 4.5软件进行半定量分析。    3、蛋白印迹（Western Blot）：将上述4种细胞分别按2×105个细胞/皿接种于35mm细胞培养皿中，细胞生长48h，

14、细胞基本长满孔底，用预冷PBS洗涤2次后，以200ul细胞裂解液，4裂解细胞30min。12,000rpm, 4离心30min。吸取上清，加入上样缓冲液，煮沸3分钟后进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳及转膜。以-actin抗体作为内参进行电泳及转膜，调平各细胞株的蛋白量，再以FT抗体进行Western Blot。即将制备好的样品进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，再将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜。封闭缓冲液（3%牛血清白蛋白，0.2%土温20的PBS）中封闭1h，加入一抗（工作浓度1:200， FT多克隆抗体），室温下摇床振荡结合2h；以洗涤缓冲液(0.2% 土温20的PBS液)洗涤2次，加

15、入二抗（1:10,000辣根过氧化物酶联兔抗小鼠二抗），室温下置于摇床振荡反应1h。室温洗膜4次，每次10分钟。按ECL试剂盒步骤加入发光试剂，显影曝光摄片，并对显示条带用Lab Work 4.5软件进行半定量分析。    4、细胞上清FT检测：将上述4种细胞进行培养传代，以2×106/皿的量，分别接种于6cm的培养皿，次日细胞贴壁后，换液，即分别加入相应的培养液4ml/皿，继续培养48h。收获细胞上清，电化学发光分析仪（德国，Roche公司，Modular E 170型，相关试剂为仪器配套试剂）检测FT含量。将培养细胞消化后收集，进行下一步的MRI显像

16、。    5、MRI显像：将上述4种培养的细胞0.25%胰酶消化后，收集离心，重悬于0.5ml 1%琼脂糖的eppendorf管中，进行MRI扫描成像。成像方法，表面线圈，矩阵256×256，FOV14cm×14cm，层厚2mm，扫描序列FSE，T1WI（TR300ms，TE12ms）、T2WI（TR2500ms，TE112ms）、PD（TR2000ms，TE13.4ms）。    结果    1、 RT-PCR： 4种细胞SK-Hep-1、HepG2、QGY-7703、L02的mRN

17、A用内参2-MG调平后，以FT的特异性引物进行RT-PCR检测各细胞株内源FT的表达量，产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，均可见一特异性扩增条带，与设计引物所应得到的FT目的基因片段大小一致。各细胞FT基因表达强度有不同（见图1），HepG2与QGY-7703表达较强， SK-Hep1表达中等，L02表达较弱。    2、 Western Blot：4种细胞SK-Hep-1、HepG2、QGY-7703、L02的细胞裂解液，以-actin调平后，进行Western Blot检测FT表达，均显示了特异性FT 蛋白条带的表达（见图2）。各细胞内源性FT表达强度有不同，Hep

18、G2和QGY-7703表达较强，SK-Hep1较弱，L02表达很弱，几乎不表达。    3、 细胞上清FT检测结果：4种细胞培养液上清中HepG2与QGY-7703分泌铁蛋白量较高，SK-Hep-1分泌较低，L02分泌量很低。具体见表1。    4、 MRI显像结果：用T1WI、T2WI和PD序列对不同细胞团进行扫描成像，见图3，各细胞团信号强度测量见图4。3种序列扫描图像均显示：信号最低为HepG2，其次为QGY-7703，SK-Hep-1为较高信号， L02信号最高。    讨论  

19、;  铁蛋白系统作为一种新颖的MRI显像系统，已开始被研究者所注意。Cohen等和Genove等利用铁蛋白基因转染细胞的体外研究与转染组织的动物实验研究10,11，显示了细胞与组织MRI信号的变化。Deans等12还将含有转铁蛋白受体和铁蛋白的复合基因，转染进入小鼠的神经干细胞，再将转基因细胞植入小鼠的脑内，观察到细胞的信号。这些都说明铁蛋白系统可以作为MRI分子影像学研究的报告系统。而以往研究的MRI显像系统，-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和转铁蛋白受体等，是依赖其某些生理作用或代谢过程，形成一些复合物，使得MRI信号发生变化而显像。如酪氨酸酶可以形成黑色素，而黑色素与多种金属离子具有高亲

20、和力，可以在MRI的T1WI中显示高信号13，14；转铁蛋白具有结合与运输铁的功能，结合氧化铁的转铁蛋白基因，转染进入转铁蛋白受体阳性的细胞，氧化铁可以使T2WI信号减低15,16；-半乳糖苷酶系统的成像原理就更复杂，-半乳糖苷酶可以将注入的半乳糖-顺磁性鳌合物水解，使得游离的顺磁性鳌合物增加，从而引起弛豫时间改变，在T1WI中显示高信号17。但这些系统本身不能够MRI显像，必须要增加一些外源性物质，形成某些特定的复合物，从而显示MRI信号变化。因此，这类MRI显像系统，其探针制备相对复杂，稳定性与安全性都需要多重认证。铁蛋白系统在这方面显示了其优势，其探针制备相对简单，含有铁蛋白单基因的质粒

21、载体就可以成为探针而转染细胞，稳定性好，安全性认证也相对简单。    但铁蛋白系统作为一种内源性显像系统，也存在一定的缺陷。由于机体本身就存在该种蛋白，其蛋白表达水平的高低变化同样也可以形成MRI信号的不同。因此将表达铁蛋白的外源性基因转染进入细胞，即外来探针引入细胞，就可能受到体内本身蛋白存在影响，而出现MRI显像的混乱。本研究就是建立在这样假设基础上的，对不同的肝癌细胞株的铁蛋白含量与MRI信号的关系进行研究分析。    机体内铁蛋白在肝脏、脾脏及脑中含量较多18。某些疾病，会导致铁代谢异常而使得铁蛋白含量发生改变，如神经系统退行

22、性病变、地中海贫血和肿瘤等19-22。目前对铁蛋白MRI显像的研究主要是针对神经系统的10-12。但肿瘤，尤其是肝癌，临床常常将检测血清中铁蛋白的含量作为一种辅助检测手段，类似于甲胎蛋白检测。那么，肝癌细胞本身的铁蛋白表达究竟如何？本实验将3种肝癌细胞和正常肝细胞的本身铁蛋白内源性表达进行了初步的检测比较，结果不同的细胞铁蛋白内源性表达水平差别较大：正常肝细胞的铁蛋白表达水平很低，本实验所检测的3种肝癌细胞铁蛋白表达水平均明显高于正常肝细胞，但不同的肝癌细胞其铁蛋白基因和蛋白表达水平也高低不同；铁蛋白表达水平高者，细胞培养液上清中所检测的铁蛋白分泌量也较高；MRI图像也显示铁蛋白表达水平低的细

23、胞为高信号，铁蛋白表达水平高的细胞为低信号。虽然本实验并非外源基因转染细胞，但从铁蛋白的基因及蛋白表达水平高低与MRI信号关系分析，可以从一定程度上说明其负相关关系，也间接证实了Cohen和Genove的实验结果。因此结合本研究及以往的研究，我们认为，如果将铁蛋白基因与其他治疗基因结合，共同转染肝癌组织细胞，可以引起原本在T2中显示高信号的肝癌组织，信号减低，从一定程度上观察和监测到肿瘤的治疗基因转染和治疗情况。这项研究我们也正在进行当中。    目前对铁蛋白的MRI显像原理、机制与特性研究，已有初步的进展。铁蛋白的分子结构，铁蛋白中心为水合氧化铁晶体，其中心达4

24、000个Fe3+，周围被2.5nm蛋白骨架包围，造成细胞内具有高磁化率，而细胞外具有低磁化率。这种磁化不均使T2弛豫时间缩短。当各种因素导致铁蛋白量发生变化，就形成MRI的信号变化，可以为MRI所检测18，23。Gossuin等8，18在体外实验中对铁蛋白与弛豫时间进行了相关性研究，用提取的高纯度的人肝/脾铁蛋白进行MRI不同强度磁场扫描，显示铁蛋白主要缩短T2时间，而T1时间变化不敏感。但本实验发现，铁蛋白含量高的细胞，在三种不同序列T1WI、T2WI和PD图像上，均显示明显低信号。与Gossuin等的结果有部分不符。是否肝癌细胞中有某些影响其弛豫时间的因素存在？正象本研究所假设的，细胞中内

25、源性物质的存在对MRI信号影响是多方面的，究竟如何才能更好地利用铁蛋白这种内源性MRI显像系统，还有待进一步研究，有待更多的相关研究提供信息。    【参考文献】  1. Dagmar Hogemann, Lee Josephson, Ralph Weissleder, et al. Improvement of MRI Probes To Allow Efficient Detection of Gene Expression, Bioconjugate Chem. 2000, 11, 941-946   

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