差别PCR技术检测卵巢癌c-erbB-2癌基因扩增的研究

1、差别 PCR 技术检测卵巢癌 c-erbB-2 癌基因扩增的研究【摘要】 目的: 探讨卵巢癌 c-erbB-2 癌基因扩增的临床意义。方法: 应用差别 PCR 技术检测 36 例原发性卵巢癌 c-erbB-2 癌基因的扩增情况。 结果: (1)卵巢癌组织中 c-erbB-2 癌基因的扩增率为 58.3%(21/36);(2)肿块5cm 的卵巢癌组织及中晚期卵巢癌患者 c-erbB-2 癌基因扩增率分别为 67.9%、73.9%，明显高于肿块5cm 的卵巢癌组织 25.0%的扩增率和早期卵巢癌患者 30.8%的扩增率，均有显著差异(P1.63 者即可判定为扩增。2.2 癌组织中 c-erbB-2

2、 原癌基因扩增情况 36 例卵巢癌组织中 21 例见 c-erbB-2 原癌基因扩增，校正拷贝数 0.933.01，扩增率 58.3%(21/36)。电泳结果见图 1。图 1 卵巢癌组织及癌旁正常组织中 c-erbB-2 癌基因差别 PCR 检测电泳结果(略)N1N4 癌旁正常卵巢组织，C1C4 卵巢癌组织标本，M：DNA Marker，其中 C1、C3 存在 c-erbB-2 基因扩增，C2、C4 未扩增。2.3 c-erbB-2 原癌基因扩增与卵巢癌临床病理的关系 c-erbB-2 原癌基因扩增与肿块大小、临床分期有显著相关性，肿块5cm、中晚期患者 c-erbB-2癌基因扩增率显著高于肿

3、块5cm、早期患者，而与患者年龄、病理类型、淋巴结转移、雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)无显著相关性。详见表 1。3 讨论c-erbB-2 又称 neu 或 HER-2 基因，由 Shih 等首次从乙基亚硝脲诱导的大鼠神经胶质纤维瘤中分离得到，Padhy 等进一步证实该癌基因与编码表皮生长因子受体(EGFR)的基因一样与病毒癌基因 v-erbB-2 具有同源序列，因此将其命名为 c-erbB-2，属于 EGFR 家族成员，包括 erbB-1、erbB-2、erbB-3 和 erbB-43。c -erbB-2 原癌基因定位于第 17 号染色体长臂 q11.2-12 位，编码 185kD具有

4、跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体，与 EGFR 具有惊人的结构相似性4。c-erbB-2 在 EGFR 家族中发挥关键作用，它与其他表皮生长因子受体一起，通过复杂的信号网络调节细胞生长、分化5-6。表 1 c-erbB-2 基因扩增与卵巢癌临床病理的关系(略)现有的研究表明，人类肿瘤细胞中 c-erbB-2 基因的异常主要为基因扩增和过度表达，少数存在着 c-erbB-2 基因的突变和重排7。基因扩增与 mRNA 及蛋白产物的高表达存在一致的关系8。c-erbB-2 通过基因扩增等途径激活，变为活化的癌基因，参与细胞生长调控，可促进细胞癌变和癌细胞生长增殖。迄今已发现在多种人类肿瘤中存在 c-

5、erbB-2 基因的扩增及/或蛋白的过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、肺癌及前列腺癌等9，表明它在肿瘤的发生、发展、转移及预后等方面发挥着作用10。本实验中我们应用差别 PCR 检测了 36 例原发性卵巢癌组织中 c-erbB-2 的扩增情况，扩增率为58.3%(21/36)，明显高于正常卵巢组织，且扩增多发生在期及期卵巢癌组织中，与 Hogdall 等11应用同种方法检测 181 例中晚期卵巢癌患者 c-erbB-2的扩增率 52.2%相近。Wu 等12对早期卵巢癌的研究发现，c-erbB-2 基因的扩增率仅为 6.7%，明显低于本实验结果。c-erbB-2 基因的扩增率在早期和晚期

6、卵巢癌患者中的显著差异，充分证实 c-erbB-2 基因的扩增及/或蛋白的过度表达，在人类卵巢癌的发生、发展进程中具有重要作用。本次研究结果显示 c-erbB-2 癌基因扩增与肿块大小密切相关，肿块5cm 的卵巢癌组织 c-erbB-2 癌基因的扩增率为 25.0%，肿块5cm 的卵巢癌组织 c-erbB-2 癌基因的扩增率为67.9%，两者有显著差异，提示 c-erbB-2 癌基因扩增具有促进细胞增殖的作用。有研究显示 c-erbB-2 癌基因蛋白产物 P185 定位于细胞微绒毛及伪足，能加速细胞运动，因此推测 P185 参与细胞生长的调节，在肿瘤细胞中增殖能力的增强与此有关13。本次研究结

7、果还显示 c-erbB-2 癌基因扩增与临床分期密切相关，临床分期越晚，其扩增和表达也越高。早期卵巢癌 c-erbB-2 癌基因扩增率为 30.8%，中晚期卵巢癌 c-erbB-2 癌基因扩增率为 73.9%，两者有显著差异，与 Afify 等14报道一致。文献也报道晚期卵巢癌患者 c-erbB-2 癌基因的扩增率高于早期患者15-16。故提示 c-erbB-2 癌基因与肿瘤细胞的增殖活跃、疾病进展密切相关。本实验结果显示，c-erbB-2 基因扩增与淋巴结转移、患者年龄、ER、PR 均无相关性,与张向宁等17、Goff 等18的研究结果一致。但有淋巴结转移的卵巢癌患者 c-erbB-2 基因

8、扩增率为 65.2%，无淋巴结转移的卵巢癌患者其扩增率为 46.2%，两者虽无显著性差异，但有淋巴结转移者其扩增率有明显上升趋势。有研究表明 c-erbB-2 的过度表达可引起许多基因改变，包括使 VEGF/VFPD的表达上调，促进肿瘤新生血管的形成，增加 MMP-9、MMP-2 的分泌，使肿瘤细胞的运动能力、侵袭能力增强19，从而导致癌瘤深部浸润及转移20。关于 c-erbB-2 癌基因扩增与卵巢癌的病理学类型的关系，目前有两种观点，其一为 c-erbB-2 在上皮性卵巢癌中高表达21，其二为 c-erbB-2 的表达与病理类型无关。本研究结果显示 c-erbB-2 的扩增与病理类型无关，与

9、大多数的研究结果相一致22，提示 c-erbB-2 癌基因参与了多种来源的卵巢肿瘤的发生、发展。综上所述，在人类卵巢癌中 c-erbB-2 基因扩增或过度表达具有重要理论和临床意义。它对卵巢癌的恶性程度、癌细胞的侵润、淋巴转移及患者预后的判断具有重要价值，并且 c-erbB-2 还有希望作为基因治疗和药物作用的靶点，其在卵巢癌的诊断、治疗中意义重大、前景广阔。c-erbB-2 基因的检测可在不同的水平上用不同的方法进行。免疫组化简便、易行，不需要特殊的设备。但其试剂不同，敏感性也不同，结果判断也因人而异，实验结果跨度很大，阳性率 11.0%68.9%23。近年来出现的差别 PCR具有简便、客观

10、、高效等特点，成为检测 c-erbB-2 的新方法24。本实验中我们应用差别 PCR 检测了 36 例原发性卵巢癌组织中 c-erbB-2 的扩增情况，扩增率为 58.3%(21/36)，明显高于自身免疫组化法测得的 30.6%(11/36)，两者有显著差异。说明差别 PCR 在检测 c-erbB-2 的扩增水平上较免疫组化法敏感，临床推广具有实际意义。本次实验应用的差别 PCR 是一种半定量 PCR 技术，是用以检测基因拷贝数改变的快速敏感的非同位素技术，已获得日益广泛的应用。其基本原理是将待测靶基因与单拷贝数参照基因在同一反应管中做 PCR 扩增，然后根据靶基因与参照基因扩增产物的电泳区带

11、的光密度值的比值，评估待测基因扩增程度。本次研究选用-actin 基因作为内参照基因，因为-actin 基因作为管家基因在细胞中表达较为恒定，而且其 GC 含量与靶基因 c-erbB-2 相似，保证了两个基因产物有大致相似的扩增效率25。该法与传统的 Southern Blot 等核酸分子杂交技术相比有以下优点：DNA 用量小;由于 PCR 扩增 DNA 片段仅几十至几百碱基，故对模板 DNA 质量要求不高;通过内参照基因及目的基因在同一体系中扩增，可减少操作过程中造成的误差，结果较可靠;技术简单、快速，无放射性污染。【参考文献】1 Eltabbakb GH,Belinson JL,Kenne

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